2.5. Строение и классификация вирусов

Вирусы - мельчайшие микробы, относящиеся к царству Virae (от лат. virus - яд). Они не имеют клеточного строения и состоят

из ДНКили РНК-генома, окруженного белками. Являясь автономными генетическими структурами и облигатными внутриклеточными паразитами, вирусы размножаются в цитоплазме или ядре клетки и не имеют собственной метаболической системы. Для них характерен особый разобщенный (дизъюнктивный) способ размножения (репродукции): в разных частях вирусинфицированной клетки синтезируются вирусные компоненты, а затем происходят их сборка и формирование вирусных частиц. Зрелая вирусная частица называется вирионом.

Структуру вирусов из-за их малых размеров изучают с помощью электронной микроскопии как вирионов, так и их ультратонких срезов. Размеры вирусов (вирионов) определяют напрямую с помощью электронной микроскопии или косвенно методом ультрафильтрации через фильтры с известным диаметром пор, методом ультрацентрифугирования. Размер вирусов колеблется от 15 до 400 нм (1 нм равен 1/1000 мкм): к маленьким вирусам, размер которых сходен с размером рибосом, относят парвовирусы и вирус полиомиелита, а к наиболее крупным - вирус натуральной оспы (350 нм). Вирусы отличаются по форме вирионов, которые имеют вид палочек (вирус табачной мозаики), пули (вирус бешенства), сферы (вирусы полиомиелита, ВИЧ), нити (филовирусы), сперматозоида (многие бактериофаги).

Вирусы поражают воображение своим разнообразием структуры и свойств. В отличие от клеточных геномов, которые содержат однородную двунитевую ДНК, вирусные геномы чрезвычайно разнообразны. Различают ДНК- и РНК-содержащие вирусы, которые гаплоидны, т.е. имеют один набор генов. Диплоидный геном имеют только ретровирусы. Геном вирусов содержит от 6 до 200 генов и представлен различными видами нуклеиновых кислот: двунитевыми, однонитевыми, линейными, кольцевыми, фрагментированными.

Среди однонитевых РНК-содержащих вирусов различают геномные плюс-нить РНК и минус-нить РНК (полярность РНК). Плюс-нить (позитивная нить) РНК этих вирусов, кроме геномной (наследственной) функции, выполняет функцию информационной, или матричной РНК (иРНК, или мРНК); она является матрицей для белкового синтеза на рибосомах инфицированной клетки. Плюс-нить РНК является инфекционной: при введении в чувствительные клетки она способна вызвать инфекционный про-

цесс. Минус-нить (негативная нить) РНК-содержащих вирусов выполняет только наследственную функцию; для синтеза белка на минус-нити РНК синтезируется комплементарная ей нить. У некоторых вирусов РНК-геном является амбиполярным (ambisense от греч. амби - с обеих сторон, двойная комплементарность), т.е. содержит плюс- и минус-сегменты РНК.

Геном вирусов может включаться в геном клетки в виде провируса, проявляя себя генетическим паразитом клетки. Нуклеиновые кислоты некоторых вирусов, например вирусов герпеса, могут находиться в цитоплазме инфицированных клеток, напоминая плазмиды. Для вирусов характерно наличие структурных и неструктурных белков. Неструктурные белки участвуют в репродукции вирусов, а структурные белки обусловливают строение вирусов. Вирусы имеют как вирусспецифические белки, так и клеточные белки, захваченные вирусом при репродукции в клетке хозяина. Липиды и полисахариды имеют в своем составе главным образом сложные вирусы.

Различают простые вирусы (например, вирус гепатита А) и сложные вирусы (например, вирусы гриппа, герпеса, коронавирусы).

Простые, или безоболочечные, вирусы имеют только нуклеиновую кислоту, связанную с белковой структурой, называемой капсидом (от лат. capsa - футляр). Протеины, связанные с нуклеиновой кислотой, известны как нуклеопротеины, а ассоциация вирусных протеинов капсида вируса с вирусной нуклеиновой кислотой названа нуклеокапсидом. Некоторые простые вирусы могут формировать кристаллы (например, вирус ящура).

Капсид включает повторяющиеся морфологические субъединицы - капсомеры, скомпонованные из нескольких полипептидов. Нуклеиновая кислота вириона, связываясь с капсидом, образует нуклеокапсид. Капсид защищает нуклеиновую кислоту от деградации. У простых вирусов капсид участвует в прикреплении (адсорбции) к клетке хозяина. Простые вирусы выходят из клетки в результате ее разрушения (лизиса).

Сложные, или оболочечные, вирусы (рис. 2.11), кроме капсида, имеют мембранную двойную липопротеиновую оболочку (синоним: суперкапсид, или пеплос), которая приобретается путем почкования вириона через мембрану клетки, например через плазматическую мембрану, мембрану ядра или мембрану эндоплазматического ретикулума. На оболочке вируса расположены гликопротеиновые шипы,

или шипики, пепломеры. Разрушение оболочки эфиром и другими растворителями инактивирует сложные вирусы. Под оболочкой некоторых вирусов находится матриксный белок (М-белок).

Вирионы имеют спиральный, икосаэдрический (кубический) или сложный тип симметрии капсида (нуклеокапсида). Спиральный тип симметрии обусловлен винтообразной структурой нуклеокапсида (например, у вирусов гриппа, коронавирусов): капсомеры уложены по спирали вместе с нуклеиновой кислотой. Икосаэдрический тип симметрии обусловлен образованием изометрически полого тела из капсида, содержащего вирусную нуклеиновую кислоту (например, у вируса герпеса).

Капсид и оболочка (суперкапсид) защищают вирионы от воздействия окружающей среды, обусловливают избирательное взаимодействие (адсорбцию) своими рецепторными белками с опреде-

Рис. 2.11. Строение оболочечных вирусов с икосаэдрическим (а) и спиральным (б) капсидом

ленными клетками, а также антигенные и иммуногенные свойства вирионов.

Внутренние структуры вирусов называют сердцевиной. У аденовирусов сердцевина состоит из гистоноподобных белков, связанных с ДНК, у реовирусов - из белков внутреннего капсида.

Лауреат Нобелевской премии Д. Балтимор предложил систему балтиморской классификации, основанной на механизме синтеза мРНК. Эта классификация размещает вирусы в 7 группах (табл. 2.3). Международный комитет на таксономии вирусов (ICTV) принял универсальную систему классификации, которая использует такие таксономические категории, как семейство (название оканчивается на viridae), подсемейство (название оканчивается на virinae), род (название оканчивается на virus). Вид вируса не получил биноминального названия, как у бактерий. Вирусы классифицируют по типу нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), ее структуре и количеству нитей. Они имеют двунитевые или однонитевые нуклеиновые кислоты; позитивную (+), негативную (-) полярность нуклеиновой кислоты или смешанную полярность нуклеиновой кислоты, амбиполярную (+, -); линейную или циркулярную нуклеиновую кислоту; фрагментированную или нефрагментированную нуклеиновую кислоту. Учитывают также размер и морфологию вирионов, количество капсомеров и тип симметрии нуклеокапсида, наличие оболочки (суперкапсида), чувствительность к эфиру и дезоксихолату, место размножения в клетке, антигенные свойства и др.

Таблица 2.3. Основные вирусы, имеющие медицинское значение

Продолжение табл. 2.3

Окончание табл. 2.3

Вирусы поражают животных, бактерии, грибы и растения. Являясь основными возбудителями инфекционных заболеваний человека, вирусы также участвуют в процессах канцерогенеза, могут передаваться различными путями, в том числе через плаценту (вирус краснухи, цитомегаловирус и др.), поражая плод человека. Они могут приводить и к постинфекционным осложнениям - развитию миокардитов, панкреатитов, иммунодефицитов и др.

К неклеточным формам жизни, кроме вирусов, относят прионы и вироиды. Вироиды - небольшие молекулы кольцевой, суперспирализованной РНК, не содержащие белок и вызывающие заболевания растений. Патологические прионы - инфекционные белковые частицы, вызывающие особые конформационные болезни в результате изменения структуры нормального клеточного прионового протеина (PrP^c), который имеется в организме животных и человека. PrP^с выполняет регуляторные функции. Его кодирует нормальный прионовый ген (PrP-ген), расположенный в коротком плече 20-й хромосомы человека. Прионные болезни протекают по типу трансмиссивных губкообразных энцефалопатий (болезнь Крейтцфельда-Якоба, куру и др.). При этом прионный протеин приобретает другую, инфекционную форму, обозначаемую как PrP^sc (sc от scrapie - скрепи - прионная инфекция овец и коз). Этот инфекционный прионный протеин имеет вид фибрилл и отличается от нормального прионного протеина третичной или четвертичной структурой.

Группы возбудителей инфекционных заболеваний. Классификация возбудителей инфекций. Группы возбудителей инфекций. Регламентация условий работы с возбудителями инфекционных заболеваний произведена в соответствии со степенью опасности микроорганизмов для человека. По этому признаку выделено четыре группы возбудителей инфекционных заболеваний. Группа I возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители особо опасных инфекций: чума, натуральная оспа, лихорадки Ласса, Эбола и др. Группа II возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители высококонтагиозных бактериальных грибковых и вирусных инфекций: сибирская язва, холера, лихорадка Скалистых гор, сыпной тиф, бластомикоз, бешенство и др. (см. также главу 8). В эту группу также включён ботулотоксин (но не сам возбудитель ботулизма). Группа III возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители бактериальных грибковых, вирусных и протозойных инфекций, выделенных в отдельные нозологические формы (возбудители коклюша, столбняка, ботулизма, туберкулёза, кандидоза, малярии, лейшманиоза, гриппа, полиомиелита и др.). В эту группу также включены аттенуированные штаммы бактерий групп I, II и III. Группа IV возбудителей инфекционных заболеваний: возбудители бактериальных, вирусных, грибковых септицемии, менингитов, пневмоний, энтеритов, токсикоинфекций и острых отравлений (возбудители анаэробных газовых инфекций, синегнойной инфекции, аспергиллеза, амебиаза, аденовирусы, герпесвирусы и др.)

Классификация инфекционных болезней

В настоящее время в ветеринарной медицине используются 5 основных типов классификаций инфекционных болезней.

1. Этиологическая (Хюбнер, Готшлих и др.). Основана на классификации микроорганизмов по фенотипическим (морфологическим, физиологическим и др.) и генотипическим (структура и гибридизация ДНК) признакам. По этой классификации инфекционные болезни подразделяются на 3 основные группы: - бактериальные (колибактериоз, лептоспироз, микоплазмоз, сальмонеллез, хламидиоз и др.); - вирусные (бешенство, вирусный энтерит, инфекционный гепатит, чума и др.); - грибковые (микроспория, трихофития и др.). 2. Зооантропонозная (А. Вейксельбаум, И.И. Елкин и др.). В зависимости от источника возбудителя инфекционные болезни разделяют на 3 группы: - антропонозы (болезни, свойственные только человеку, который является источником возбудителя инфекции); - зоонозы (болезни, присущие только животным, которые являются источником возбудителя инфекции); - зооантропонозы (болезни, общие для человека и животных; источником возбудителя инфекции могут быть животные и (или) человек). 3. Эпизоотологическая (М.С. Ганнушкин и др.). Основана на систематизации путей проникновения возбудителя болезни в организм.

По этой классификации инфекционные болезни подразделяются на 5 групп:

- алиментарные (главные факторы передачи возбудителя инфекции - инфицированные корма, вода, почва и навоз); - аэрогенные (воздушно-капельные инфекции); - трансмиссивные (возбудитель инфекции передается живыми переносчиками - насекомыми, клещами); - инфекции с заражением животных непосредственно через внешние покровы без участия переносчиков; - инфекции с невыяатенными путями заражения (неклассифицированная группа). Указанные выше группы болезней дополнительно подразделяют на подгруппы.

4. По локализации болезни (В.Б. Башенин, Л.В. Громашевский и др.). Классификация основана на локализации возбудителя инфекции в организме и на механизме его передачи, в соответствии с этим болезни разделяют на 4 группы: - кишечные инфекции (локализация возбудителя в основном в кишечнике); - инфекции дыхательных путей (локализация возбудителя в слизистых оболочках дыхательной системы - альвеолах, бронхах, зеве и др.); - кровяные инфекции (локализация возбудителя в кровеносной и лимфатической системах); - инфекции наружных покровов (включают болезни кожи, ее придатков, наружных слизистых оболочек, а также раневые инфекции). 5. По виду и возрасту животных. По данной классификации, положенной в основу программы курса эпизоотологии для высших и средних специальных учебных заведений России по специальности "Ветеринария", все инфекционные болезни животных подразделяют на 10 групп: - болезни, общие для всех или нескольких видов домашних животных; - болезни молодняка; - болезни жвачных; - болезни свиней; - болезни лошадей; - болезни птиц; - болезни кроликов; - болезни плотоядных; - болезни пчел; - болезни прудовых рыб

Приведенные выше классификации инфекционных болезней позволяют дополнительно выделить и учитывать специфические особенности конкретных болезней, а также источники возбудителей инфекций и пути их проникновения в организм животных; установить основные участки локализации болезни; определить вид и группы животных, наиболее подверженных определенным заболеваниям. Все это необходимо учитывать при разработке и применении методов и средств диагностики, терапии и профилактики при инфекционных болезнях собак и кошек.

Например, генотипические и фенотипические признаки патогенных микроорганизмов определяют степень их устойчивости к воздействию различных факторов внешней среды.

По устойчивости к химическим дезинфицирующим средствам возбудителей основных инфекционных болезней животных разделяют на четыре группы (С.П. Убираев, 1999 г.): - малоустойчивые (возбудители болезни Ауески, лептоспироза, сальмонеллеза и др.); - устойчивые (возбудители бешенства, вирусного энтерита, инфекционного гепатита плотоядных,  микроспории, трихофитии, чумы плотоядных и др.); - высокоустойчивые (возбудители туберкулеза животных, паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота и др.); - особо устойчивые (возбудители сибирской язвы, брадзота, эмкара и других споровых инфекций).

Для профилактической и вынужденной дезинфекции рекомендуется использовать растворы химических средств, приведенные в табл.

Таблица. Сравнительная устойчивость возбудителей инфекционных болезней животных к химическим дезинфицирующим средствам

Наименование дезинфицирующего средства	Концентрация дезинфицирующих средств (%) соответственно группе устойчивости возбудителя
	1-я группа	2-я группа	3-я группа	4-я группа
Гипохлорид кальция нейтральный	2	3	5	5
Глутаровый альдегид	0,5	1	1	2
Дезонол	5	10	-	-
ДП-2	1,5	2	4	5
Известь свежегашеная	20	20	20	-
Известь хлорная	2	3	5	5
Йод однохлористый	5	5	10	10
Лизол	5	-	-	-
Натр едкий	2	4	3	10
Препараты на основе надуксусной кислоты	0,3	0,5	1	-
Сода кальцинированная	5	-	-	-
Фенолят натрия технический раствор	4	5	-	-
Феносмолин	3	5	8	18
Формалин, параформальдегид	2	2	3	4
Фрезот	2	4	3	-

Примечания. Прочерк в таблице (-) обозначает, что препарат для дезинфекции не применяют. Для профилактической дезинфекции применяют химические дезинфицирующие средства в концентрации, указанной для возбудителей 1-й группы устойчивости.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ - способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических, гематологических и других исследованиях (см. Бактериологическое исследование, Гистологические методы исследования, Кровь, Микроскоп, Цитологическая диагностика).  Обычная световая микроскопия предназначена для изучения окрашенных препаратов на предметных стеклах. С помощью световой микроскопии можно исследовать подвижность микроорганизмов. Для этого применяют метод висячей капли. Небольшую каплю микробной взвеси наносят на середину покровного стекла. Предметное стекло с углублением ("лункой"), края к-рого смазаны вазелином, осторожно накладывают на покровное стекло так, чтобы капля исследуемой жидкости оказалась в центре углубления, плотно прижимают к стеклу и быстро переворачивают кверху. Для исследования препарата используют иммерсионный объектив, к-рый погружают в иммерсионное масло на покровном стекле. 

Методы микроскопического исследования микроорганизмов используют при изучении формы и структуры клетки, определении подвижности микробов, изучении включений микробной клетки. МИКРОСКОПИЯ В СВЕТОВОМ, ОПТИЧЕСКОМ МИКРОСКОПЕ Микроскоп — сложный прибор, оптическая часть которого смонтирована на специальном штативе. Штатив состоит из основания и отходящей от него колонки, к которой подвижно прикреплены тубус и столик микроскопа. С колонкой связаны две винтовые системы: макрометрический винт, позволяющий быстро передвигать тубус, и микрометрический винт для детальной, более точной установки его. Внизу тубуса расположен объектив—увеличивающая оптическая система, которая дает действительное изображение рассматриваемого объекта. На объективах имеется обозначение силы увеличения: 10Х, 40Х, 90Х. Даваемое объективом изображение увеличивается при помощи второй системы увеличительных стекол, составляющих окуляр. Он находится в верхнем конце тубуса и увеличивает действительное изображение в 8—15 раз. В большинстве микроскопов свет отражается от регулируемого зеркала, расположенного у основания микроскопа. Пройдя через линзу конденсора, свет фокусируется на объекте. В современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света (рис. 18) . Разрешающая сила светового микроскопа, определяющая возможность прибора давать отдельное изображение каждой из двух близких точек объекта, зависит от длины волны видимого света (Я) и числовой, или нумерической, апертуры (NA) линз объектива. Предел разрешающей способности микроскопа, т. е. минимальное расстояние между двумя точками, при котором можно различить каждую из них составляет 200—250 нм. Для увеличения разрешающей силы микроскопа, т. е. уменьшения предела разрешения, используют свет с меньшей длиной волны, например ультрафиолетовый с длиной волны 200— 300 нм (люминесцентная микроскопия). Способы приготовления препаратов для микроскопии. При помощи светового микроскопа можно изучать микроорганизмы, как в живом, так и в окрашенном состоянии. При исследовании микробов в живом состоянии можно получить представление о размерах, форме и характере их движения. Иногда внутри живой клетки видны блестящие, сильно преломляющие свет гранулы и споры. Для изучения микробов в живом состоянии готовят препараты висячей и раздавленной капли. Для приготовления препарата висячей капли (рис. 19) бактериологической петлей в центр покровного стекла наносят небольшую каплю исследуемого материала, суспендированного в жидкости (изотонический раствор хлорида натрия, мясопептонный бульон). Затем берут специальное стекло с луночкой в центре и края ее смазывают вазелиновым маслом. Луночкой предметного стекла накрывают каплю исследуемого материала на покровном стекле так, чтобы капля находилась в центре луночки. Слегка прижимают предметное стекло и быстро переворачивают. При правильном приготовлении препарата капля свисает в луночку. Вазелиновое масло предохраняет ее от высыхания. Препарат раздавленной капли готовят нанесением капли суспендированного в жидкости материала на предметное стекло, которое затем накрывают покровным.

Помимо световой существуют фазово-контрастная, темнопольная (ультрамикроскопия), люминесцентная, поляризационная, ультрафиолетовая и электронная микроскопия.  Фазово-контрастная микроскопия основана на интерференции света: прозрачные объекты, отличающиеся по показателю преломления от окружающей среды, выглядят либо как темные на светлом фоне (позитивный контраст), либо как светлые на темном фоне (негативный контраст). Фазово-контрастная микроскопия применяется для изучения живых микроорганизмов и клеток в культуре ткани.  Темнопольная микроскопия (ультрамикроскопия) основана на рассеянии света микроскопическими объектами (в т. ч. теми, размеры к-рых меньше предела разрешения светового микроскопа). При темнопольной микроскопии в объектив попадают только лучи света, рассеянного объектами при боковом освещении (аналогично эффекту Тиндаля, примером к-рого является обнаружение пылинок в воздухе при освещении узким лучом солнечного света). Прямые лучи от осветителя в объектив не попадают. Объекты при темнопольной микроскопии выглядят ярко светящимися на темном фоне. Применяется темнопольная микроскопия преимущественно для изучения спирохет и обнаружения (но не изучения морфологии) крупных вирусов.  В основе люминесцентной микроскопии лежит явление люминесценции, т. е. способности нек-рых веществ светиться при облучении их коротковолновой (сине-фиолетовой) частью видимого света либо ультрафиолетовыми лучами с длиной волны, близкой к видимому свету. Люминесцентная микроскопия используется в диагностических целях для наблюдения живых или фиксированных микроорганизмов, окрашенных люминесцирующими красителями (флюорохромами) в очень больших разведениях, а также при выявлении различных антигенов и антител с помощью иммунофлюоресцентного метода (см. Серологические исследования).  Поляризационная микроскопия основана на явлении поляризации света и предназначена для выявления объектов, вращающих плоскость поляризации. Применяется в основном для изучения митоза.  В основе ультрафиолетовой микроскопии лежит способность нек-рых веществ (ДНК, РНК) поглощать ультрафиолетовые лучи. Она дает возможность наблюдать и количественно устанавливать распределение этих веществ в клетке без специальных методов окраски. В ультрафиолетовых микроскопах используется кварцевая оптика, пропускающая ультрафиолетовые лучи.  Электронная микроскопия принципиально отличается от световой как устройством электронного микроскопа, так и его возможностями. В электронном микроскопе вместо световых лучей для построения изображения используется поток электронов в глубоком вакууме. В качестве линз, фокусирующих электроны, служит магнитное поле, создаваемое электромагнитными катушками. Изображение в электронном микроскопе наблюдают на флюоресцирующем экране и фотографируют. В качестве объектов используют ультратонкие срезы микроорганизмов или тканей толщиной 20- 50 нм, что значительно меньше толщины вирусных частиц. Высокая разрешающая способность современных электронных микроскопов позволяет получить полезное увеличение в миллионы раз. С помощью электронного микроскопа изучают ультратонкое строение микроорганизмов и тканей, а также проводят иммунную электронную микроскопию.