2. Экстракция.
При твердожидкофазной экстракции вещество из твердой фазы переходит в жидкую, при жидкожидкофазной – из одной жидкости в другую (например, хлорофилл из спиртовой вытяжки переходит в бензин). Для извлечения антибиотиков, витаминов, каротиноидов, липидов применяют жидкожидкофазную экстракцию, когда культуральную жидкость смешивают с органическими растворителями.
Адсорбция – частный случай экстракции, когда экстрагирующий агент – твердое тело. Адсорбция применяется для веществ, имеющих функциональные группы, заряженные положительно или отрицательно. В качестве адсорбента используют иониты на основе целлюлозы: - катионит - карбоксиметилцеллюлоза (КМЦ); - анионит - диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ), а также сефадексы на основе декстрана и т.д. Адсорбция идет по ионообменному механизму.
В№ 2.катаболитная репрессия (глюкозный эффект)
Опосредованное глюкозой подавление транскрипции генов, которые кодируют ферменты, вовлеченные в катаболическне процессы (например, лак-оперон).
Некоторые аспекты уф-чувствительности бактериальных штаммов Escherichia coli
В настоящее время большое внимание уделяется изучению влияния УФ- и g-излучения на бактериальные клетки [1]. При действии коротковолнового УФ-света основной клеточной мишенью является ДНК, в связи с чем изучение особенностей УФ-чувствительных мутантов может способствовать выяснению механизмов сохранения стабильности генетического материала клеток [2].
Целью настоящей работы было изучение УФ-чувствительности бактериальных штаммов E.coli К12 АВ1157, E.coli К12 АВ1185, E.coli G35 N49 и E.coli G35 N61.
В качестве полноценных питательных сред для выращивания бактериальных культур использовали 0.7- и 2%-ный мясопептонный бульон (МПБ) и 2 %-ный мясопептонный агар (МПА), а в качестве минимальной среды - М-9. УФ-облучение предварительно разбавленной физиологическим раствором культуры (104-106 кл/мл) производили с помощью лампы БУВ-30 на расстоянии 50 см дозами 1.25×10-5, 2.5×10-5, 3.5×10-5, 5×10-5, 7×10-5, 15×10-5 Дж/см2.
Глюкозный эффект, обнаруживаемый в радиобиологических экспериментах, является, по-видимому, частным случаем давно известного в биохимии глюкозного эффекта, сущность которого сводится к подавлению глюкозой ряда неспецифических для этого вещества ферментов. Глюкозный эффект играет определенную роль в выживаемости бактерий и дрожжей при УФ-облучениях.
Хорошо известно, что при выращивании некоторых штаммов E.coli в средах с повышенным содержанием глюкозы наблюдается повышение резистентности этой "глюкозной" культуры [3]. Однако отметим, что разные штаммы E.coli реагируют на наличие глюкозы в среде по-разному. Глюкозный эффект наблюдается у E.coli B / r и K-12, но отсутствует у клеток E.coli B, BS-1, rec- - и rec- uvr- E.coli K-12. У E.coli B наблюдается даже обратный эффект, т.е. повышение чувствительности клеток, выращенных в средах, содержащих глюкозу.
Билет 25. В№ 3.Пенициллин — первый антибиотик, то есть антимикробный препарат, полученный на основе продуктов жизнедеятельности микроорганизмов. Он был обнаружен в 1928 году Александром Флемингом в культуре плесневых штамма грибков Penicillium Notatum на основе случайного открытия, что попадание в культуру бактерий плесневого грибка из внешней среды оказывает бактерицидное действие на культуру.
В 1940—1941 году английский бактериолог Хоуард У. Флори, а также биохимики Эрнст Чейн и Норман У. Хитли работали над выделением и промышленным производством пенициллина сначала в Англии, затем в США. Они впервые использовали его для лечения бактериальных инфекций в 1941 году. В 1945 году Флемингу, Флори и Чейну была присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине «за открытие пенициллина и его целебного воздействия при различных инфекционных болезнях».
В СССР первые образцы пенициллина получили в 1942 году микробиологи З. В. Ермольева и Т. И. Балезина. Зинаида Виссарионовна Ермольева активно участвовала в организации промышленного производства пенициллина. Созданный ею препарат пенициллин-крустозин ВИ ЭМ, превосходивший недоступный зарубежный аналог, был получен из штамма грибков Penicillium Crustosum. Он спас жизни многих бойцов Советской Армии.
Антибиотик группы биосинтетических пенициллинов. Оказывает бактерицидное действие за счёт ингибирования синтеза клеточной стенки микроорганизмов.
Активен в отношении грамположительных бактерий: Staphylococcus spp., Streptococcus spp. (в том числе Streptococcus pneumoniae), Corynebacterium diphtheriae, Bacillus anthracis;
грамотрицательных бактерий: Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis;
анаэробных спорообразующих палочек
а также Actinomyces spp., Spirochaetaceae.
Антибиотикотерапия, десятилетиями используемая для лечения бактериальных заболеваний, порождает всемирное распространение и засилье антибиотикоустойчивых штаммов. На смену традиционным профилактическим и лечебным методам химического воздействия приходит фаготерапия – уничтожение вредоносных бактерий естественными средствами.
Ныне установлено, что бактериофаги представляют собой разновидность вирусов – микроскопических неклеточных образований, состоящих из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК) и белковой оболочки, иногда содержащей липиды. Все вирусы видоспецифичны и способны размножаться только в живых клетках-хозяевах (см. статью «Родить можно, не выходя из дома»). Наряду с вирусами растений и животных существуют и вирусы бактерий. В отличие от антибиотиков, специфические бактериофаги способны оказывать действие на определенные патогенные микробы, не нарушая естественного баланса нормальной микрофлоры высшего организма. Их выборочное влияние обусловлено природой взаимодействия с бактериями: контактом белков-сенсоров фага с белками-рецепторами (или характерными липидами) клеточной стенки бактерии. Проникнув внутрь болезнетворной клетки, фаг переключает генетический механизм роста клетки на воспроизводство себе подобных фагов. Последние, вдоволь размножившись, разрывают оболочку клетки-хозяина и лавиной атакуют другие микробы. Весь процесс от начала атаки одиночных фагов до воспроизводства целого полчища из десятков тысяч новобранцев занимает около тридцати минут. Полное освобождение от паразитов в организме происходит за считанные часы. При этом, разрушая определенный вид бактерий до последнего представителя, фаги не атакуют и не разрушают другие виды, широко представленные в организме и выполняюРадужные надежды ученые связывают с генно-инженерными бактериофагами, которые менее специфичны, чем природные аналоги, и вводят в клетку гены, кодирующие много убивающих белков. Устойчивость к генно-инженерным фагам у бактерий развивается медленнее, чем к природным фагам, поэтому их не приходится так часто заменять.щие полезные функции.
Билет 26.В №1.Организмы с клеточным строением делятся на две группы: прокариотические (доядерные) организмы – бактерии и цианобактерии и эукариотические (истинно ядерные) организмы – все остальные. В основе такого деления лежат различия в строении прокариотической и эукариотической клетки.
Для прокариотической клетки характерно:
отсутствие ядра, ограниченного мембраной;размещение генетического материала в одной хромосоме – одной кольцевой молекуле ДНК, расположенной в ядерной области цитоплазмы, называемой нуклеотидом;
отсутствие мембранных органелл;
выполнение функций отсутствующих органелл лизосомами – структурами, сформированными путем впячивания плазматической мембраны;
наличие жесткой защитной оболочки – клеточной стенки, под которой находится цитоплазматическая мембрана;
размножение путем простого деления надвое (амитоз); отсутствие митоза и мейоза;
наличие рибосом, включений (гликоген, липиды и др.).
Для эукариотической клетки характерно:
наличие ядра, окруженного ядерной мембраной;
сосредоточение генетического материала преимущественно в хромосомах (в ядре), имеющих сложное строение;
митотический тип деления;
наличие большого количества различных органелл мембранного и немембранного строения;
присутствие различных 1.4. Основные компоненты клетки. Клеточная оболочка
Любая клетка в норме состоит из трех основных компонентов: цитоплазматической мембраны, цитоплазмы и ядра (рис. 4).
Оболочка клетки (биологическая мембрана) состоит из плазматической мембраны, надмембранного комплекса (гликокаликс или клеточная стенка) и субмембранного опорно-сократительного аппарата. Проявляя тесное функциональное единство, эти три компонента клеточной оболочки образуют поверхностный аппарат клетки.
Цитоплазматическая мембрана, или клеточная мембрана, или плазмалемма окружает клетку, отделяя внутреннее содержимое от внешней среды. Помимо этого, плазмалемма выполняет еще целый ряд очень важных функций.
Мембрана биологическая (от лат. мембрана – кожица) – белково-липидная структура молекулярных размеров (не более 10 нм толщиной), расположенная на поверхности клеток (клеточная мембрана), канальцев и пузырьков, а также внутриклеточных образований – ядер, митохондрий и т.д. Обладая избирательной проницаемостью, регулирует в клетках и их частях концентрацию солей, сахаров, аминокислот и других продуктов обмена веществ, их транспорт и обмен.Мембрана клеточная (от лат. мембрана – кожица) – биологическая мембрана, окружающая протоплазму живой клетки. Участвует в регуляции обмена веществ между клеткой и окружающей ее средой. У некоторых клеток клеточная мембрана служит единственной структурой, служащей оболочкой (клетки крови, кожи и др.). У других клеток (в частности, у растительных) наружная оболочка, кроме клеточной мембраны, состоит еще из нескольких слоев-оболочек
Кроме плазматической мембраны эукариотическая клетка содержит большое количество внутренних мембран, одна из функций которых – разделение клетки на отдельные участки – компартменты. Внешняя и внутренние мембраны формируют мембранную систему клетки.
Основная структура любой мембраны – липидный бислой, который относительно непроницаем для большинства водорастворимых молекул. Два молекулярных слоя липидов могут быть представлены фосфолипидами и гликолипидами, соотношение которых различно в клетках разных типов.
Различные молекулы белка располагаются на поверхности липидного бислоя или погружены в него на разную глубину с наружной и с внутренней стороны.
Мембранные белки обладают способностью свободно перемещаться в плоскости мембраны, обеспечивая движение веществ через нее. Мембранные транспортные белки есть во всех типах биологических мембран; они могут значительно отличаться друг от друга, обладая определенной специфичностью. Другими словами, движение различных групп веществ (неорганические ионы, аминокислоты, сахара и т.д.) осуществляется разными транспортными мембранными белками
Тотипотентность (англ. totipotency, от лат. totus — весь, целый, совокупный, potentia — сила, мощь, возможность) — это возможность клетки делиться и образовывать дифференцированные клетки организма, в том числе наружние ткани эмбриона. Тотипотентные клетки образуются в течение полового и бесполого размножения и представляют собой споры и зиготы. Зиготы — это продукты слияния двух гамет в результате оплодотворения. У некоторых организмов клетки могут дедифференцироваться и обретать тотипотентность. Срезанные части растений и каллус могут быть использованы для выращивания целого растения.
Билет 26 В 2.Ретроингибирование
Ингибирующее действие конечного продукта цепи биохимических реакций на активность, как правило, самого первого из ферментов (регуляторного), катализирующих данную последовательность реакций, либо фермента, находящегося в точке разветвления мультиферментной системы; Р. является механизмом саморегуляции ферментативной активности, причем во многих саморегулируемых по типу Р. системах регуляторный фермент поливалентен, т.е. подчиняется действию более чем одного специфического модулятора; Р. атранилсинтазы и триптофансинтетазы только триптофаном было впервые показано А.Новиком и Л.Сцилардом в 1953.
АЛЛОСТЕРИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ (от алло.... и греч. stereos - пространственный), контроль за скоростью протекания отдельных метаболических процессов в организме за счёт изменения активности регуляторных (аллостерических) ферментов. Направлена на наиболее экономичное использование материальных и энергетических ресурсов клетки. Аллостерические ферменты обладают четвертичной структурой (состоят из нескольких полипептидных цепей) и помимо активного центра имеют обособленные "аллостерические" центры (один или несколько) на поверхности своих молекул. К этим центрам присоединяются специфические регуляторы, так называемые эффекторы, изменяющие активность фермента, а следовательно, и всего метаболического процесса в целом. В качестве эффекторов часто выступают нуклеотиды (например, адениловая кислота, АТФ и т. п.), аминокислоты (в реакциях биосинтеза др. аминокислот) и другие.
Аллостерическая регуляция анаболических (биосинтетических) путей осуществляется в основном по принципу обратной связи, когда конечный продукт биосинтетической цепи подавляет действие фермента, катализирующего начальную стадию всего процесса (так называемое ретроингибирование). В катаболических путях, обеспечивающих клетку энергией, активность первого фермента контролируется соединениями, которые показывают уровень энергетического состояния клетки в каждый данный момент, например, фосфатами и адениловыми нуклеотидами. Для некоторых метаболических путей известна ситуация, когда первый метаболит в цепи последовательных реакций активирует фермент, катализирующий последнюю стадию, обеспечивая так называемую активацию предшественником.
Некоторые вещества вызывают необратимое ингибирование ферментов. Рассмотрим два примера такого рода.
Очень малые концентрации ионов тяжелых металлов, например ионов ртути (Hg2+), серебра (Ag+) и мышьяка (As+), а также определенные иодсодержащие соединения полностью ингибируют некоторые ферменты. Эти вещества необратимо соединяются с сульфгидрильными группами (—SH) в молекуле фермента (рис. 4.13), причем сульфгидрильные группы могут находиться как в активном центре фермента, так и вне его. В любом случае структура фермента нарушается и он теряет способность осуществлять катализ. Может произойти и осаждение ферментного белка.
Другой пример необратимого ингибирования — действие диизопропилфторфосфата (ДФФ), соединения из группы нервно-паралитических отравляющих веществ. ДФФ связывается с остатком аминокислоты серина, находящимся в активном центре фермента ацетилхолинэстеразы. Этот фермент инактивирует ацетилхолин, играющий роль нейромедиатора. Одна из функций ацетилхолина заключается в обеспечении передачи нервного импульса от одного нейрона к другому через синаптическую щель.
Почти сразу после передачи очередного импульса ацетилхолинэстераза инактивирует ацетилхолин, расщепляя его молекулы. Если адетилхолинэстераза ингибирована, то ацетилхолин накапливается, нервные импульсы следуют один за другим, и мышца длительное время не расслабляется. В конце концов наступает паралич, а может наступить и смерть, поскольку затронутыми оказываются также мышцы грудной клетки, в результате чего происходит остановка дыхания. Некоторые из применяемых в настоящее время инсектицидов (например, паратион) оказывают такое же действие на насекомых. Нервную и мышечную системы человека они тоже способны повреждать.
Один из самых обычных способов регуляции метаболических путей — это регуляция с помощью аллостерических ферментов. Аллостерическими называют ферменты, действие которых «по определению» связано с изменением формы (alios — иной, другой; stereos — форма).
Активность таких ферментов регулируют вещества, действующие подобно неконкурентным ингибиторам. Эти вещества присоединяются к ферментам в особых участках, удаленных от активного центра, и меняют активность фермента, вызывая обратимое изменение в структуре активного центра.
В результате меняется и способность субстрата связываться с ферментом (чем данное явление и отличается от неконкурентного ингибирования). Действующие таким образом вещества называются аллостерическими ингибиторами. Рисунок поясняет механизм аллостерического ингибирования.
Примером данного явления служит реакция, протекающая во время гликолиза, который составляет одну из стадий процесса клеточного дыхания. Клеточное дыхание служит источником АТФ. Если концентрация АТФ высока, то АТФ, действуя как аллостерический ингибитор, подавляет активность одного из ферментов гликолиза. Если же клеточный метаболизм усиливается, а следовательно, АТФ расходуется и его общая концентрация падает, то после того как ингибитор будет удален, данный метаболический путь снова вступает в действие. Это может также служить примером ингибирования конечнымпродуктом.
