Билет№23

1. Начиная биотехнологический процесс получения ЛС в варианте биосинтеза нужно внести в систему не просто достаточную концентрацию,а соблюсти 2-ое обязательное условие-внести биообъект в экспоненциальнлой фазе роста. Особенностью биообъектов в исп-ии в фармтехнологии можно считать их потребность в многокомпонентных С,Н,О,P,N конц-ия элементов в различных биообъектах различна. Рец. Пит.среды – B=C*H*O*P*N,где klmnp числовые коэф-ты,полученные делением массовой доли элемента на атомную массу. Биологическая роль каждого из элементов в метаболических клет превращ. Исследловалась многократно, статистически было установлено-сущ-ет количественная закономерность влияния конц-ции элементов пит.среды на скор. Роста биомассы, а также взаимовлияние их на удельную скорость роста биообъектов.

2-

3 Эйкозаноиды — окисленные производные полиненасыщенных жирных кислот —, арахидоновой , тимнодоновой. Пищевыми источниками полиненасыщенных жирных кислот являются растительные масла, рыбий жир и препараты омега-3-жирных кислот.

Депонироваться эйкозаноиды не могут, разрушаются в течение нескольких секунд, поэтому клетка должна синтезировать их постоянно из поступающих в неё соответствующих жирных кислот.

Выделяют три основные группы эйкозаноидов:

простагландины

лейкотриены

тромбоксаны

Простагландины (Pg) – синтезируются практически во всех клетках, кроме эритроцитов и лимфоцитов. Выделяют типы простагландинов A, B, C, D, E, F. Их функции сводятся к изменению тонуса гладких мышц бронхов, мочеполовой и сосудистой систем, желудочно-кишечного тракта, при этом направленность изменений различна в зависимости от типа простагландинов и условий. Они также влияют на температуру тела.

Билет № 24. 1)Основу питательных сред для культивирования микроорганизмов составляют источники углерода. Кроме углерода клетки микроорганизмов в процессе роста испытывают потребность в азоте, фосфоре, макро- и микроэлементах. Все вещества этого рода находятся в питательных средах в виде солей, исключение составляют среды, где азот и фосфор могут усваиваться растущими культурами из органических источников, например автолизатов или гидролизатов микробного или животного происхождения. Отделения приготовления питательной среды представляет собой цех, оборудованный емкостями для хранения жидких и твердых веществ, средствами их транспортировки и аппаратами с перемешивающими устройствами для приготовления растворов, суспензий или эмульсий. При этом питательные соли хранятся обычно в твердом виде, а приготовление их смеси с заданным соотношением компонентов производится в аппарате с мешалкой, куда подаются твердые компоненты в необходимом количестве и далее происходит их растворение. Иногда соединяются и перемешиваются заранее приготовленные растворы. Жидкие и твердые источники углерода обычно вводят в уже готовую питательную среду непосредственно перед ферментацией, так как это устраняет опасность заражения посторонней микрофлорой, вероятность которого возрастает при хранении готовой питательной смеси. Важнейшим элементом приготовления питательных сред является соблюдение требований асептики. Это либо создание заданного значения рН, обеспечивающего подавление посторонних микроорганизмов, либо полная стерилизация всех подаваемых потоков и самого биореактора.

Для стерилизации газовых потоков (в первую очередь воздуха) используют процесс фильтрации через специальные волокнистые фильтры с последовательно расположенными фильтрующими элементами. Фильтрующий материал периодически стерилизуется подачей острого пара в отключенный фильтр через заданные промежутки времени. Жидкостные потоки стерилизуют различными методами, из которых практический интерес представляют термический, радиационный, фильтрационный и отчасти химический. Термический - самый распространенный, при температурах порядка 120-150оС. Радиационный - g-излучение, применяется редко из-за трудностей создания и эксплуатации мощных источников этого излучения. В отдельных случаях применяют химические стерилизующие агенты (вещества с ярко выраженным асептическим действием). Основная проблема в этом случае - необходимость устранения стерилизующего агента из питательной среды после гибели микрофлоры до внесения инокулята. Химические антисептики должны быть не только высокоэффективны, но и легко разлагаемы при изменении условий после завершения стерилизации. К числу лучших относится пропиолактон, обладающий сильным бактерицидным действием и легко гидролизуемый в молочную кислоту. Мало распространен и метод фильтрации, что объясняется аппаратными трудностями. Метод основан на способности полупроницаемых мембран с крупными порами пропускать жидкую фазу и концентрировать клетки микроорганизмов. В принципе этот метод является идеальным для стерилизации термически неустойчивых жидких и газовых средств, поскольку может осуществляться при низкой температуре и требует лишь градиента давления по разные стороны мембраны. Основная трудность - наличие термостойких мембран, способных выдерживать многократную стерилизацию их самих. В настоящее время эта проблема решается путем применения термостойких полимеров в производстве мембран.

В заключение заметим, что ряд субстратов не требует стерилизации, так как они сами обладают асептическим действием; сюда относят метанол, этанол, концентрированная уксусная кислота и др. В этом случае ограничиваются стерилизацией прочих элементов питательной среды.

Критерий Дейндорфера-Хемфри: около 80 и более- критерий стерильности:

= К *t, К- константа скорости гибели микроорганизмов от тем-ры

t – время продолжительности стерилизации.

Стерилизации текучим паром подвергаются те растворы и питательные среды, которые разрушаются при стерилизации под давлением. Такую стерилизацию проводят также в автоклавах при избыточном нулевом давлении и температуре 100 °C . Применяют «дробную стерилизацию» - трех- или четырехкратную обработку с интервалом в 1 сутки , во время которого не успевшие погибнуть споры бактерий прорастают в вегетативные формы и погибают от действия пара и температур. Многие клетки млекопитающих, прежде чем приступить к пролиферации и образовать клеточный монослой, должны прикрепиться к субстрату и распластаться на нем. В связи с этим встает вопрос о подходящем материале. В качестве субстрата в настоящее время используют несколько материалов. Стекло лучше всего пирекс (алюмоборосиликатное стекло), так как натрийсиликатное стекло может подщелачивать среду и его необходимо кипятить в слабой кислоте перед употреблением. С каждым использованием пригодность такого стекла падает. Пластик - чаще всего используют полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон и другие. Металлы - подходит как нержавеющая сталь, так и титан, так как эти вещества химически инертны и обладают высоким отрицательным поверхностным зарядом. Клетки прикрепляются за счет электростатических взаимодействий, поэтому поверхность культуральных сосудов должна быть смачиваемой и отрицательно заряженной. Этого можно достичь химической обработкой окисляющими агентами или физическими воздействиями (высоковольтным разрядом, ультрафиолетовым светом, бомбардировкой высокоэнергетическими электронами). Фирмы, производящие пластиковую посуду, используют эти методы. Некоторые исследователи, несмотря на это, предпочитают даже новую посуду перед посадкой клеток обрабатывать смесью концентрированной серной кислоты и бихромата калия (хромовая смесь), после чего следует тщательная промывка. Иногда поверхность сосуда покрывают веществом, облегчающим прикрепление клеток. Наиболее часто для этого используют коллаген и полиаминокислоты.

В№2.Институт биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) был основан в июне 1965 года как один из институтов, строящегося в те годы Центра биологических исследований Академии наук. В основу первой исследовательской программы Института, сформулированной в 1963 году, были положены следующие задачи:

В Институте были созданы лаборатории, сыгравшие важную роль в становлении и развитии отечественной микробиологии и биотехнологии. Руководство этими лабораториями и отдельными направлениями осуществляли и осуществляют ученые, имеющие мировое признание: Н.Д. Иерусалимский, Г.К. Скрябин, .А. Баев,Л.В. Калакуцкий, А.М. Боронин, И.С. Кулаев и др. С их именами связаны крупные вехи развития биохимии, микробиологии, молекулярной биологии и биотехнологии в нашей стране.

В фондах ВКМ хранится и поддерживается более 14000 микробных культур, что составляет около 70% от видового фонда России, 82 % видов имеются только в ВКМ, которая является международным органом по депонированию микроорганизмов. Созданы и опубликованы Указатели и Каталоги микроорганизмов. Фонд поддерживаемого видового микробного разнообразия является самым ОТУ является уникальной по совокупности параметров базой для разработки широкого спектра биотехнологий для промышленного получения препаратов на основе микробиологического синтеза. При этом основное внимание уделяется наукоемким технологиям. Разработанные технологии могут использоваться в различных сферах деятельности - медицине, ветеринарии, растениеводстве, пищевой промышленности.

С самого начала организации Института исследования фундаментального характера тесно соседствовали с созданием научных основ биотехнологии, а в последние годы - биотехнологии защиты окружающей среды, большое значение при этом придавалось развитию молекулярной биологии, генетики и биоинженерии, а также коллекционированию микробного разнообразия.

Суперпродуцент- (супер- + лат. producens, producentis производящий)

Микробный штамм, нацеленный на синтез определенного продукта в высокой концентрации.

В № 3.Клеточная инженерия — необычайно перспективное направление современной биотехнологии. Учёные разработали методы выращивания в искусственных условиях (культивирование) клеток растений животных и даже человека. Культивирование клеток позволяет получать различные ценные продукты, ранее добываемые в очень ограниченном количестве из-за отсутствия источников сырья. Особенно успешно развивается клеточная инженерия растений. Используя методы генетики, удаётся отбирать линии таких клеток растений — продуцентов практически важных веществ, которые способны расти на простых питательных средах и в то же время накапливать ценных продуктов в несколько раз больше, чем само растение. Выращивание массы клеток растений уже используется в промышленных масштабах для получения физиологически активных соединений. Налажено, например, производство биомассы женьшеня для нужд парфюмерной и медицинской промышленности. Закладываются основы производства биомассы лекарственных растений — диоскореи и раувольфии. Разрабатываются способы выращивания клеточной массы других редких растений — продуцентов ценных веществ (родиолы розовой и др.). Другое важное направление клеточной инженерии — клональное микроразмножение растений на основе культуры тканей. Основан это метод на удивительном свойстве растений: из отдельной клетки или кусочка ткани в определённых условиях может вырасти целое растение, способное к нормальному росту и размножению. Этим методом из небольшой части растения можно получить до 1 млн растений в год. Клональное микроразмножение используется для оздоровления и быстрого размножения редких, хозяйственно ценных или вновь созданных сортов сельскохозяйственных культур. Методы клеточной инженерии позволят значительно ускорить селекционный процесс при выведении новых сортов хлебных злаков и других важных сельскохозяйственных культур: срок их получения сокращается до 3-4 лет (вместо 10-12 лет, необходимых при использовании обычных методов селекции). Перспективных способом выведения новых сортов ценных сельскохозяйственных культур является также разработанный учёными принципиально новый метод слияния клеток. Большие успехи достигнуты клеточной инженерией в области иммунологии: разработаны методы получения особых гибридных клеток, производящих индивидуальные, или моноклональные, антитела. Это позволило создать высокочувствительные средства диагностики ряда тяжёлых заболеваний человека, животных и растений. Значительный вклад вносит современная биотехнология в решение такой важной проблемы, как борьба с вирусными заболеваниями сельскохозяйственных культур, наносящими большой ущерб народному хозяйству. Учёные разработали высокоспецифичные сыворотки для выявления более 20 вирусов, вызывающих заболевания различных сельскохозяйственных культур. Новые методы диагностики позволяют отбирать для посадки свободный от вирусов исходный материал (семена, клубни и др.), что способствует значительному повышению урожая. Важное практическое значение имеют работы по инженерной энзимологии. Первым важным успехом её была иммобилизация ферментов — закрепление молекул ферментов с помощью прочных химических связей на синтетических полимерах, полисахаридах и других носителях-матрицах. Закреплённые ферменты более стабильны, их можно использовать многократно. Иммобилизация позволяет осуществлять непрерывные каталитические процессы, получать продукцию, не загрязнённую ферментом (что особенно важно в ряде пищевых и фармакологических производств), значительно снизить её себестоимость. Иммобилизованные клетки являются наиболее экономичными биокатализаторами, так как обладают высокой активностью и стабильностью, а главное — применение их полностью исключает затраты на выделение и очистку ферментов.

Биообъект - продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, который катализирует одну присущую ему реакцию. Биотехнология использует либо продуценты-микроорганизмы, растения, высших животных, либо изолированые индивидуальные ферменты. Фермент иммобилизуется (закрепляется) на нерастворимом носителе, что позволяет его использовать многократно.

Билет 25. Ферментация, устройство ферментера. Стадия ферментации - центральная среди этапов промышленного производства. Под ферментацией понимают всю совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную и термостатированную среду инокулята до завершения процессов роста, биосинтеза или биотрансформации.

Ферментация проходит в специальных емкостях, называемых ферментерами или биореакторами. Конструкция биореактора приведена на рис. 3. Основными элементами ферментера являются двойные стенки, промежуток между которыми заполняется охлаждающей или нагревающей жидкостью, входные отверстия для газовых и жидких потоков, система контроля за составом питательной среды и условиями внутри реактора.

Поскольку в промышленной биотехнологии выделяют 2 типа процессов - накопление биомассы и накопление ценных веществ, возникающих в ходе роста и последующего развития культуры, то меняется и характер построения производства во времени. Биомасса одноклеточных выращивается непрерывным способом в аппаратах хемостатного типа, а все процессы второй группы осуществляются периодически, когда в одном и том же аппарате в производственном цикле протекают все необходимые фазы развития клеток и биосинтеза. Процессы двух рассматриваемых типов отличаются по требованиям к степени асептики, что связано с их объёмами - белок одноклеточных выпускается миллионами тонн сухого вещества, а выпуск продуктов второго типа составляет, как максимум, тысячи или десятки тысяч тонн. Поэтому в производстве белковых веществ ограничиваются достаточно высокой, но не 100% степенью асептики, обеспечивая последнюю подбором режима культивирования, подходящего для продуцента, но неблагоприятного для возможных примесных штаммов.

Технологическое оформление процессов промышленной биотехнологии в значительной мере определяется отношением микроорганизма-продуцента к кислороду. При использовании аэробных культур ферментационное оборудование и нормы технологического режима подбираются таким образом, чтобы массообмен (перенос кислорода из газовой в жидкую фазу) обеспечивал поступление кислорода к клеткам в количествах, необходимых и оптимальных для данной культуры в данной фазе роста.

Промышленное использование факультативных анаэробов не ставит задачи абсолютного исключения кислорода из среды, поэтому процессы этого типа (брожение) технологически проще аэробных. В начальной фазе этих процессов требуется лишь удалить кислород из газовой фазы над культуральной жидкостью, что может быть достигнуто введением инертного газа или просто вытеснением воздуха углекислотой, выделяемой клетками при метаболизме.

Технологическое оформление строго анаэробных процессов сложнее, чем для процессов брожения, так как в этом случае необходимо полностью исключить возможность попадания кислорода в газовую, а оттуда и в жидкую среду.Вопросы термостатирования ферментационного процесса (подвода или отвода тепла в ходе ферментации) являются очень острыми в целом ряде производств биотехнологии. В аэробных условиях микробиологический синтез протекает со значительным тепловыделением, что вызывает необходимость отвода тепла из аппаратов большого объема (сотни и тысячи кубометров). Технологические требования к скорости теплоотвода очень жесткие из-за узкого температурного оптимума роста культуры (2-3up>оС). Наиболее приемлимый на практике способ теплоотвода - охлаждение водой через змеевики, рубашки и др. устройства - осложняется небольшой разностью температур между содержимым биореактора (32-34оС для дрожжей Candida) и охлаждающей водой (20оС), температура которой в жаркое время года еще выше. Поэтому в реакторе создается развитая поверхность газообмена, увеличивается скорость движения жидкостей и т.д.

Важно также поддерживать определенный состав питательной среды. В непрерывных процессах биосинтеза задача технолога сводится к поддержанию концентрации всех питательных веществ (и кислорода) и дозированному введению кислоты или щелочи для рН-статирования системы на заданном уровне. Простейшим вариантом управления стадией ферментации в периодическом режиме является изменение концентраций компонентов среды и её рН, а также введение необходимых добавок по заранее разработанной программе, реализуемой технологом в каждом цикле ферментации. Этот способ относительно прост и легко поддается автоматизации.

Во многих случаях необходимо возможно полно исчерпывать компоненты питательной среды, чтобы они не попадали на последующие стадии переработки. Эта необходимость может быть вызвана рядом причин:

- дороговизна или дефицитность субстрата;

- вредное воздействие субстрата на качество готового продукта(например, при производстве дрожжей на парафинах , когда выделение остаточных количеств углеводородов из клеточной массы затруднено, поэтому добавляют дополнительные секции для дозревания или утилизации запасенных в цитоплазме углеводородов);

- затруднения, возникающие на стадии выделения и очистки метаболитов при одновременном присутствии в культуральной жидкости неутилизированных веществ.

Метод маштабирования- (урожай) это увеличение питательной среды на порядок (1:10),это увеличение пассажа.

Отделение твердой фазы (мелкодисперсный клеточный материал, внутриклеточные биополимеры возможно и методом фильтрации. Так как фильтруемая суспензия склонная к гелеобразованию, то производительность фильтров быстро падает. Предотвратить это можно добавлением в смесь или на фильтрующую ткань размолотых вулканических пород, содержащих оксиды кремния и алюминия, тогда осадки приобретают пористую структуру.

Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость. В большинстве промышленных производств на первом этапе переработки культуральной жидкости производят отделение массы продуцента от жидкой фазы – сепарацию. Жидкость далее также подвергается переработке, если содержит метаболиты, представляющие практическую ценность. В производствах, где целевым продуктом являются клетки как источник белка, культуральная жидкость подвергается лишь очистке, позволяющей использовать водную фазу многократно и снизить образование сточных вод.Некоторые виды биомассы отделяют центрифугированием. Осаждение взвешенных частиц происходит под действием центробежной силы. После разделения образуется 2 фракции: биомасса (твердая) и культуральная жидкость.

Культуральная жидкость перерабатывается путем экстракции, ионообмена, кристаллизации или с помощью микро- и ультрафильтрации через полимерные мембраны со специально подобранным размером пор.

Для выделения и очистки продуктов, находящихся внутри клеток продуцента (например интерферонов, гормонов) вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы); обычно для этого применяются механические, химические или комбинированные методы. К физическим методам дезинтеграции относятся обработка ультразвуком, вращение лопасти или вибратора, встряхивание со стеклянными бусами, продавливание через узкое отверстие под давлением, раздавливание замороженной клеточной массы, растирание в ступке, осмотический шок, замораживание-оттаивание, декомпресия (сжатие с последующим резким снижением давления). 1. Осаждение – физическое (нагревание, охлаждение, разбавление, концентрирование) или химическое (с помощью органических и неорганических веществ).Высаливание - механизм тот же, что и при действии органических веществ, гидратируются диссоциирующие ионы неорганических солей. Как наиболее дешёвый реагент используют сульфат аммония. Также применяют сульфаты натрия, магния и фосфат калия.