Билет 15

2,Иммобилизация путем включения в гели состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку, образованную тесно переплетающимися нитями (цепями), формирующими гель. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой приходится обычно значительная часть общего объема геля. Для иммобилизации фермента в геле существует два основных способа:

при одном из них фермент вводится в водный раствор мономера, а затем уже проводят полимеризацию, в результате которой формируется гель с включенными в него молекулами фермента,

второй способ состоит в том, что фермент вносится в раствор уже готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в требуемое состояние, гелеобразное состояние.

Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б – включение в поры геля, в – отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г – использование двухфазной реакционной среды

В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки.Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

3,Получение трансгенных животных Современные методы селекции сельскохозяйственных животных базируются на использовании внутривидовой генетической изменчивости. Как правило, виды генетически изолированы друг от друга и не скрещиваются между собой, так как этому препятствует репродуктивная изоляция. В классической селекции, где используют для скрещивания животных с половой совместимостью, нельзя применять межвидовую генетическую изменчивость и создавать новые генетические формы, так как рекомбинация генов происходит только между хромосомами животного одного вида. Преодолеть биологические границы видов и использовать межвидовую генетическую изменчивость для создания новых форм животных можно с помощью переноса генов. Под переносом чужеродного гена понимают пересадку in vitro рекомбинацией конструкции гена в клетки другого животного вне зависимости от его видовой принадлежности. Если рекомбинантная конструкция гена интегрировалась в геном другого животного, то такой ген обозначается как трансген. Кодируемый трансгеном белок носит название трансгенного продукта. Животное, которое содержит в своем геноме трансген, называется трансгенным. Если животные передают трансгены своим потомкам, то образуются родственные группы трансгенных животных – трансгенные линии. Для переноса генов млекопитающих используют три метода: Микроиньекцию рекомбинантной ДНК в пронуклеос зиготы; Использование ретро вирусов в качестве векторов; Инъекцию трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион. Все методы переноса генетической информации млекопитающих охватывают ранние этапы онтогенеза-от оплодотворенной яйциклетки до формирования бластоцисты, способной имплантироваться в матку реципиента. Перенос генов методом микроиньекции ДНК в пронуклеус зиготы. Суть метода заключается в следующем. Из яйцевода самки извлекают зиготы, освобождают их от окружающих фолликулярных клеток, инкубируют в средах Дюльбекко или Виттена под объективом микроскопа. Зиготу фиксируют микропипеткой. С противоположной стороны подводят инъекционную микропипетку, в которой находится раствор с геном. Для инъекции чужеродной ДНК в мужской пронуклеус зиготы используют плазмиды с конструкциями, промотор и структурный ген. В мужской пронуклеус инъецируют около 1 пл буферного раствора с рекомбинантной ДНК, содержащей до 100 и более копий гена. Как правило, 60-80% реконструированных зигот хорошо переносят микроманипуляции. После оценки жизнеспособности зиготы трансплантируют ложнобеременной самке-реципиенту другой генетической линии. Для подтверждения интеграции чужеродного гена от мышат, родившихся из реконструированных зигот, извлекают кусочек ткани из хвоста или печени. ДНК из ткани этих органов анализируют с помощью дот - и блот - гибридизации В большинстве экспериментов выход трансгенных мышей, оцененных по методу дот - и блот - гибридизации, составляет 1%. Однако экспрессия чужеродного гена происходит у 5-10% полученных трансгенных мышей. Для оценки стабильности наследования чужеродных генов в процессе смены поколений методами дот - и блот - гибридизации анализируют потомство трансгенных животных. Использование ретровирусов в качестве векторов. При переносе чужеродных генов в оплодотворенные в соматические клетки животных в качестве векторов используют ретровирусы, способные внедрятся в геном эмбрионов. Ретровирусы относятся к семейству РНК-содержащих вирусов. Содержат молекулы одноцепочной линейной РНК и обратную транскриптазу (ревертазу)- фермент, с помощью которого в клетке происходит специфический синтез ДНК на РНК. В этом случае генетическая информация передается в обратном направлении от РНК к ДНК. Обратная транскриптаза в ретровирусах способна синтезировать по матрице РНК комплиментарную в ней цепь ДНК, которая служит матрицей другой комплиментарной ДНК-цепи. Вследствие этого создается двуспиральная молекула ДНК, содержащая генетическую информацию вирусной РНК. Такая ДНК интегрируется в хромосомную ДНК клетки, образуя провирус. Под провирусом понимается форма существования генома вируса, при которой этот геном объединен с генетическим материалом клетки-хозяина в единые молекулы ДНК. После интеграции репликация провируса проходит совместно с ДНК клетки хозяина, вследствие чего провирус передается дочерним клеткам. Первые результаты по интеграции ДНК аденовируса обезьян в геном мыши были получены в России в 1981 г. Впоследствии для избежания инфекционного процесса в эмбрионе стали использовать дефектный ретровирусный вектор, конструирование которого проводится на основе клонирования терминальных фрагментов длинных концевых повторов LTR,находящихся на ДНК. В этих повторах расположены регуляторные последовательности, определяющие репликацию ДНК ретровируса и экспрессию его генов. Для синтеза вирусоспецифических ферментов необходимо присутствие вируса-помощника, у которого после микрохирургии отделяют фрагмент инкапсидации. В результате развивается инфекционный процесс, который заканчивается формированием ретровирусного вектора. Инъекция трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион. Клеточные популяции, из которых образуются ткани-это клоны, возникши из эмбриональных стволовых клеток или клеток – родоначальниц. Стволовые клетки способны делиться и дифференцироваться в одном или нескольких направлениях. Эмбриональные стволовые клетки получают из бластоцисты мыши. Такие клетки можно размножать, культивировать in vitro, создавать банки клеток с желательными генетическими свойствами. В выделенные клетки можно инъецировать генные конструкции. Эмбриональные стволовые клетки следует отличать от эмбриональных тератокарциномных стволовых клеток, которые можно выделить из опухоли и культивировать in vitro. При трансплантации млекопитающих тератокарциномных клеток под кожу у животных возникают тератокарциномы. Если инъецировать тератокарциномные клетки в бластоцисту или агрегировать их с бластомерами нормального эмбриона, можно получить химерных эмбрионов. Развитие их приведет к рождению жизнеспособных химерных мышей, в органах и тканях которых обнаружатся тератокарциномные клетки. У части животных эмбриональные тератокарциномные клетки образовывали репродуктивные органы, и при скрещивании таких химер в первом поколении рождались животные, генетически тождественные животным с эмбриотератокарциноми клетками. Эмбриональные тератокарциномные стволовые клетки обозначают буквами ЕС, линии эмбриональных стволовых клеток, полученные из доимплантационных эмбрионов, называют ES- клетками. Доказано, что линии ES-клеток хорошо культивируются in vitro, сохраняя при этом нормальный кариотип. Если инъецировать в бластоцисту мыши ES-клетки, длительно культивировавшиеся in vitro, то они принимают участие в развитии различных органов и тканей. В лабораторных условиях получены жизнеспособные мыши-химеры, в организме которых идентифицированы потомки линии ES-клеток, в том числе и в гонадах. Установлено, что в половых железах химерных мышей за счет потомков ES- клеток в 20% случаев образуются нормальные половые клетки. С помощью эмбриональных стволовых клеток были получены трансгенные мыши. Для получения трансгенных животных необходима генетическая трансформация выделенных ES-клеток, прежде чем последует их включение в реципиентную бластоцисту. Для проведения генетической трансформации ES-клеток используют два физических метода-электропорацию и микроинъекцию. Суть электропорации состоит в переносе ДНК непосредственно через клеточную мембрану с помощью высоковольтных электрических импульсов. Методом микроиньекции вводят чужеродный ген в ядра ES-клеток. Метод использования эмбриональных стволовых клеток, который на мышах признан классическим, создает неограниченные возможности в разведении сельскохозяйственных животных как в отношении трансплантации ES-клеток в бластоцисту, так и путем создания и селекции генотипов трансформированных клеточных линий в условиях культивирования in vitro.ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, программируемый геномом процесс биосинтеза белков и(или) РНК. При синтезе белков экспрессия гена включает транскрипцию - синтез РНК с участием фермента РНК-полимеразы; трансляцию - синтез белка на матричной рибонуклеиновой кислоте, осуществляемый в рибосомах, и (часто) посттрансляционную модификацию белков. Биосинтез РНК включает транскрипцию РНК на матрице ДНК, созревание и сплайсинг. Экспрессия гена определяется регуляторными последовательностями ДНК; регуляция осуществляется на всех стадиях процесса. Уровень экспрессии гена (кол-во синтезируемого белка или РНК) строго регулируется. Для одних генов допустимы вариации, иногда в значит. пределах, в то время как для других генов даже небольшие изменения кол-ва продукта в клетке запрещены. Нек-рые заболевания сопровождаются повышенным уровнем экспрессии гена в клетках пораженных тканей, напр. определенных белков, в т. ч. онкогенов при онкологич. заболеваниях, антител при аутоиммунных заболеваниях. Различают экспрессию гена: 1) конститутивную - происходящую в клетке независимо от внешних обстоятельств. Сюда относят экспрессию генов, определяющих синтез макромолекул, необходимых для жизнедеятельности всех клеток, и спец. генов (тканеспецифичная экспрессия гена), характерных для конкретного вида клеток. 2) Индуцибельная экспрессия гена определяется действием к.-л. агентов - индукторов. Ими м. б. гормоны, ростовые в-ва и в-ва, определяющие дифференцировку клеток (напр., ретиноевая к-та). Индукция может происходить на определенной стадии развития организма, в определенной ткани; время и место индукции регулируются геномом. Как правило, изменения в экспрессии гена носят необратимый характер, по крайней мере в нормальных клетках. У раковых и трансформированных клеток эта закономерность может нарушаться. В роли индукторов м. б. также и факторы внешней среды, напр. изменение т-ры, питательные в-ва. После прекращения действия индуктора первоначальная картина экспрессии гена восстанавливается (временная экспрессия гена). Большое значение экспрессия гена имеет в оптимизации синтеза белков методами генетич. инженерии. В качестве продуцента используют бактерии, дрожжи, растительные и животные клетки и даже живые организмы, такие организмы называют трансгенными. Искусственные гены конструируются таким образом, чтобы получить макс. кол-во желаемого продукта с миним. затратами, другими словами, чтобы достичь максимально высокого уровня экспрессии активного белка. Для сильной экспрессии в искусств, гене используют "сильные" регуляторные последовательности генов, обеспечивающие наибольшую продукцию белка. Часто эти последовательности ДНК имеют вирусное происхождение. Описаны случаи экспрессии целевого продукта в бактериях до уровня 50% от всего клеточного белка, Как правило, суперэкспрессирован-ные белки нерастворимы и секретируются в периплазматич. пространство бактерии. Особую сложность представляет получение белков, токсичных для клетки. В таких случаях используют строго индуцибельные системы (напр., РНК-по-лимеразу фага Т7 и ген с промотором для нее) или системы, позволяющие быстро выводить продукт наружу (секретирую-щие системы). Тем не менее, достичь высокой продукции нек-рых белков все же не удается. наиб. дорогим является получение белков в животных клетках.