Билет 14
1,Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.
Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:
1. Получение биологически активных веществ растительного происхождения:
традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);
синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;
культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ (реакции окисления, восстановления, гидроксилирования, метилирования, деметилирования, гликолизирования, изомеризации). В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.
2,Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:
- адсорбция на нерастворимых носителях;
- включение в поры геля;
- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);
- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.
Перечисленные подходы проиллюстрированы рисунке 5.
Способы иммобилизации ферментов: а - адсорбция на нерастворимых носителях, б – включение в поры геля, в – отделение фермента с помощью полупроницаемой мембраны, г – использование двухфазной реакционной среды
Адсорбционная иммобилизация достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка.
Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток.
Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор.
Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем.
3, Переход специализированных неделящихся клеток к пролиферации связан с их дедифференциацией, другими словами — утратой специализации. В основе этого процесса, как и при дифференциации клеток в интактном растении, лежит дифференциальная активность генов. Структура и функции клеток определяются активностью генов, и если клетки различаются по своей структуре и функциям, то это обусловлено различиями в экспрессии их генов, то есть специализация обеспечивается «включением» разных генов в разных клетках. Обычно активна небольшая часть (5%) всего пула генов, свойственных данному виду. В этот состав активных генов входят, кроме видоспецифичных и обязательных для поддержания клеточного метаболизма, гены, активные только в данном органе, ткани, клетке, а также гены, активные лишь в определенном возрасте или начавшие работать только под влиянием изменившихся внешних условий.Возникновение физиологических и структурных различий между клетками и тканями растений, связанное с их функциональной специализацией, называют процессом дифференциации. Понятие «дифференциация» отражает превращение эмбриональной, меристематической клетки в специализированную. Меристематические клетки, однотипные по структуре и функции, начинают развиваться различными путями, создавая ткани разных органов. Как это осуществляется — один из труднейших вопросов клеточной биологии. Между геномами в клетках, которые приобретают разную форму и функцию, по-видимому, нет качественных различий, и клетки эти начинают различаться только вследствие разной экспрессии генов. Вновь возникшая клетка обладает широкими потенциями и может развиваться по любому из многих путей в морфологическом и физиологическом смысле.
Детерминация (определение) пути развития каждой клетки является основой физиологии развития. Вступление на тот или иной путь развития определяется особым набором белков, т. е. каждая специализированная клетка вырабатывает только ей свойственные белки, что является следствием дифференциальной активности генов — экспрессии одной группы генов при одновременной репрессии других. Способность одной-единственной зрелой соматической клетки дать начало целому организму (тотипотентность) показывает, что в процессе нормальной клеточной дифференциации у растений не происходит утраты или необратимой инактивации каких-либо генов.
У растений почти всякая дифференциация обратима при условии, если дифференцированная клетка живая, в протопласте сохранилось ядро и не образовалась вторичная оболочка. Даже такие высокоспециализированные клетки, как микроспоры, с помощью ряда экспериментальных процедур можно заставить пролиферировать и дать начало целому растению. Итак, в определенных условиях многие из зрелых растительных клеток сохраняют способность делиться, а в некоторых случаях даже вступить на новый путь развития. Однако вопрос о том. как это происходит, какие события на молекулярном уровне сопровождают этот процесс, остается открытым.
Таким образом, после деления перед каждой дочерней клеткой открывается одна из трех возможностей. Клетка может оставаться эмбриональной и вновь вступить в клеточный цикл с последующим митозом либо может оказаться как бы «вне цикла» (Go), перестав делиться, и наконец, приобретя компетенцию, постепенно детерминироваться и вступить на путь дифференцировки (специализации). Компетенция — способность клетки воспринимать индуцирующее воздействие и специфически реагировать на него изменением развития.
Создание клеточных культур растений. Основным типом культивируемой растительной клетки является каллусная. Каллус (или каллюс) – это наименее дифференцированная ткань, возникающая путем неорганизованной пролиферации клеток органов растений. В обычных условиях каллус возникает при повреждениях и функционирует непродолжительное время. Однако в экспериментальных условиях каллус получают из апикальных меристем, из паренхимы корнеплодов, из флоэмы, из гаплоидных тканей пыльников. К образованию каллуса неспособны лишь крайне специализированные ткани, например, ксилема.
Культивирование клеток растений производят или поверхностным способом или в жидкой питательной среде. В любом случае необходимо подобрать определенное соотношение компонентов питательной среды. В состав питательной среды обязательно входят: углеводы (сахароза или глюкоза), минеральные соли, витамины, регуляторы роста; иногда добавляют дрожжевой экстракт или растительные экстракты. Поддерживается определенная температуры, кислотность, газовый состав.
итательные среды для растительных биотехнологических объектов
Успех в культивировании объектов зависит от правильного выбора питательной среды и тщательности её приготовления. В состав питательных сред входят макро- и микроэлементы (N, P, K, Ca, S, Mg, Fe, B, Zn, Cu, Co, Mn, J, Mo); витамины В1, В6, В12, РР и другие; углеводы (сахароза, глюкоза, маннит); фитогормоны (чаще всего цитокинины и ауксины в определенном соотношении). Ауксины вызывают клеточную дедифференцировку, цитокинины индуцируют деление дедифференцированных клеток и необходимы для получения каллусных тканей. На средах без гормонов растут “привыкшие” и опухолевые ткани. Для получения стеблевого морфогенеза снижают содержание ауксинов. Из ауксинов чаще всего применяют 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) - 0.1-10 мг/л, нафтилуксусную кислоту (НУК) - 0.1-2 мг/л, ИУК - 1-30 мг/л. Для индукции каллусогенеза используют более высокие концентрации ауксинов, в дальнейшем ткань может расти при более низком содержании ауксинов. В качестве цитокининов используют кинетин, 6-бензиламинопурин (БАП), зеатин (0.001-10 мг/л); из них кинетин наименее активен. В состав некоторых сред входит аденин. Иногда используют гибберелловую кислоту (ГК). В качестве ростактиваторов применяют также кокосовое молоко, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и др. Состав питательных сред для культивирования биотехнологических объектов зависит от типа их питания: - среда без глюкозы - для хлореллы, цианобактерий; - среда без витаминов и гормонов - для грибов (фузариума, ботритиса) и для ряски (Lemna); - среда с азотом, сахарами, витаминами и гормонами - для культивирования клеток и тканей высших растений. Разработано много питательных сред, но большинство из них представляют модификации основных: Мурасиге-Скуга (МС), Уайта, Шенка-Хильдебрандта, Гамборга (В5), Линсмайера-Скуга, Хеллера, Чапека и др. Составы питательных сред, получивших наибольшее распространение приведены в справочниках по физиологии растений и биотехнологии. На сайте вы найдете прописи для базовых сред для культивирования растительных клеток: среда Мурасиге-Скуга и среда Гамборга, некоторые микробиологические среды. Заводить и вести культуру растительных клеток гораздо проще. Растительные культуры поддерживают при температурах от 22 до 27оС, в темноте или при освещении. Среды для них - несложные, и их легко приготовить самому. Культивировать можно на твердых питательных средах с добавлением агар-агара, крахмала (методика изложена в главе "питательные среды" или на жидких питательных средах, с использованием мостиков из ваты и фильтровальной бумаги: Когда мы проводили работы по селекции каллусов на среде с ПЭГ (очень сильный осмотик, имитирующий засуху в этих экспериментах), то столкнулись с проблемой - агар в присутствии высоких концентраций полиэтиленгликоля не застывал после автоклавирования. Выход был найден - на дно пробирок или баночек клали комочек ваты (рыхлый), сверху - вырезанный по диаметру сосуда кусочек фильтровальной бумаги, заливали жидкой питательной средой так, чтобы ее уровень не превышал 1 мм над поверхностью бумаги. Высота столбика среды в пробирке диаметром 2 см - примерно 1-1,5 см, в баночке из под детского питания - 0,5 см. Суспензионные культуры растительных клеток поддерживать гораздо сложнее - необходима мешалка для постоянного перемешивания среды. Иначе эксплант погибнет, в первую очередь, от отсутствия доступа кислорода. Условия освещения различны в зависимости от поставленных вами задач. Каллусную ткань обычно получают в темноте. Клональное микроразмножение проводят при освещении. В качестве источника света лучше пригодны лампы дневного света. Они не нагревают камеру и имеют более или менее подходящий для растений спектральный состав света.
Ti-плазмида (Ti-plasmid, tumor inducing plasmid) - Плазмида почвенной бактерии Agrobacterium tumefaciens, специфический Т-участок которой способен включаться в клетки двудольных растений и внедряться в их ядерную ДНК, что ведет к образованию специфических опухолей (галлов); содержит гены, контролирующие синтез редких аминокислот (опинов) – октопина, нопалина, агропина; элементы Ti-плазмид широко используются в качестве векторов в генной инженерии растений.
Генетическая колонизация растения A. tumefaciens: 1- агробактерии существуют в ризосфере; 2 - строение A. tumefaciens; 3 – встраивание Т-ДНК в геном; 4 – образование опухоли Vir гены-Набор генов на Тi-плазмиде, которые подготавливают фрагмент Т-ДНК для переноса в растительную клетку. Наличие Ti-плазмид в клетках агробактерий является абсолютно необходимым условием патогенности микроорганизма. Излеченные от Ti-плазмид штаммы агробактерий авирулентны. На вирулентность Agrobacterium tumefaciens оказывают влияние различные мутации, котируемые как на опухолевых плазмидах, так и на хромосомах. Ранние этапы взаимодействия агробактерий с растениями, так же как хемотаксис, прикрепление к поверхности растительной клетки и специфическое связывание в центрах инфекции контролируются генами, имеющими хромосомную локализацию. В хромосоме расположены некоторые гены, регулирующие экспрессию vir-генов Ti-плазмид [19]. Присоединение агробактерий к клеткам растения является одним из первых этапов, определяющих эффективное взаимодействие. Этот этап у Agrobacterium tumefaciens контролируют два связанных между собой хромосомных локуса Chva и Chvb, размерами 1,5 kb и 5kb, соответственно [19]. Гены этих локусов экспрессируются конститутивно. В результате транспозонного мутагенеза этих областей получают авирулентные или дефекнтые по прикреплению агробактерии. Мутации в этих локусах сильно понижают или ингибируют вирулентность бактерии, но не для всех хозяев. Локус Chvb определяет синтез нейтрального циклического -D-гликана, который трансформируется в периплазматическое пространство клетки с помощью продукта гена Chva. Роль нейтрального -D-гликана в инфекционном процессе еще точно не установлена. Помимо циклического -D-гликана в прикреплении патогенных агробактерий к растительным клеткам принимают участие и другие полисахариды, в частности внеклеточные экзополисахариды. Вирулентные гены агробактерий на Ti- и Ri-плазмидах кластеризованы в области vir разметом около 30-35 kb, проявляющей в этих плазмидах значительную гомологию ДНК. Выявлена также гомология vir-генов Ti-плазмид Agrobacterium tumefaciens с tra-генами конъюгитивных плазмид. В Ti-плазмидах в области vir локализовано шесть различных групп комплементации A, B, C, D, E и G, организованных в единый регулон [Stachel Nester, 1986]. Октопиновая Ti-плазмида Arh 5 имеет дополнительный локус vir F, расположенный справа от локуса vir E [Kooykaas et al., 1984]. Мутации в генах и vir A, vir G, vir B и vir D придают агробактериям авирулентный фенотип, в отличие от большинства хромосомных мутаций, имеющих круг трансформируемых растений-хозяев.
Продукты генов vir-области контролируют процессинг тДНК в бактериальной клетке, ее перенос в растительную клетку и интеграцию в ядерный геном растения, причем эти процессы гены vir могут определять не только в цис, но и в транс положении по отношению к тДНК (то есть находясь в разных репликонах). Исходя из этого свойства области vir, сконструированы и успешно используются в практике удобные бинарные векторы для генетической инженерии растений [Дрейпер с соавт, 1991]. Для процессов "вырезания" тДНК из плазмиды (точнее, высвобождения в процессе репликативного синтеза) и ее переноса в растение необходимо фланкирование этой области особыми границами: несовершенными прямыми повторяющимися последовательностями ДНК размером 24, проявляющими значительную гомологию у всех изученных Ti- и Ri-плазмид. Границы тДНК гомологичны области oriT конъюгативных плазмид. В этой области сайт-специфические эндонуклеазы производят одноцепочечный разрыв, служащий началом репликации по типу разматывающегося рулона, происходящей в процессе транспорта плазмиды. Репликация обеспечивает сохранение плазмиды в материнской клетке и появление ее копии в дочерней.