Билет 10

1.Протеомика — наука, основным предметом изучения которой являются белки и их взаимодействия в живых организмах, в том числе — в человеческом. Учёные, работающие в области протеомики, исследуют «производство» белков, их декомпозицию и замену белков внутри тела. Они также изучают как белки модифицируются после их синтеза в организме. Традиционно изучение белков являлось одним из разделов биохимии, но после определения структуры всей геномной ДНК человека и ряда других организмов, у исследователей белков появились новые методы, с которыми и связывают появление нового термина протеомика (от протеин и геномика). В частности, появились исчерпывающие базы данных о структуре всех белков человека, а также их протеолитических фрагментов, полученных в стандартных условиях. Это позволяет идентифицировать белки по молекулярной массе их протеолитических фрагментов, полученных в тех же условиях.Несомненно, что на парадигмах современной химиотерапии, а точнее – химиотерапии ближайшего будущего должно сказаться развитие протеомики

Главный проект геномики - международный проект "Геном человека". Сейчас усилия ученых, занятых в нем, направлены на расшифровку последовательности нуклеотидов в геноме человека. Параллельно идут работы с некоторыми другими организмами. Это необходимая часть работы, потому что последовательность нуклеотидов полностью описывает геном.

Проект "Геном человека" успешно выполняется. К началу 2000 года у человека расшифрована одна из 46 хромосом (под номером 22), это 1,7 % от генома. В ней находится около 500 генов. Всего расшифровано около 15% всего генома человека. Полностью расшифровали последовательности нуклеотидов в геномах более 200 вирусов, 300 бактерий, а также более сложных организмов: дрожжей, круглого червя нематоды, плодовой мушки дрозофилы, растения под названием арабидопсис. Эти успехи были достигнуты во многом благодаря тому, что в западных странах (в основном, в США) были созданы крупные центры, оснащенные мощным автоматизированным оборудованием и хорошими компьютерами. Они позволяют расшифровать геном бактерии за две - три недели. Раньше, пять лет назад, на это был нужен год.

Расшифровка генома позволит перейти к новой области науки - протеомике - изучению всей совокупности белков организма.

2. Техника генетического конструирования in vitro включает несколько

последовательных процедур

1) получение нужного гена;

2) встраивание его в генетический элемент, способный к репликации

(вектор);

3) введение гена, входящего в состав вектора, в организм-реципиент;

4) идентификацию (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели же- лаемый ген или гены

Введение гена в плазмиду E. coli и клонирование рекомбинантной ДНК в клетках

(по А. Сассону, 1987).

Плазмида E.coli расщепляется рестриктазой в обеих частях ДНК с образованием на концах неспаренных

нуклеотидов (ТТАА или ААТТ). Ген выщеплен с помощью этой же рестриктазы с образованием на концах,

комплиментарных плазмиде, последовательностей (ААТТ и ТТАА). Обе ДНК (гена и плазмиды) сшивают с

помощью лигазы. Гибридную плазмиду вводят в E. coli, которая при размножении образует клон, все клет-

ки которого содержат рекомбинантную плазмиду и чужеродный ген. Ген клонирован в бактериальной

клетке и индуцирует в ней синтез белка.

3. Моноклональные антитела — антитела, вырабатываемые иммунными клетками, принадлежащими к одному клеточному клону, то есть произошедшими из одной плазматической клетки-предшественницы. Моноклональные антитела могут быть выработаны на почти любое вещество (в основном белки и полисахариды), которое антитело будет специфически связывать. Они могут быть далее использованы для детекции(обнаружения) этого вещества или его очистки. Моноклональные антитела широко используются в биохимии, молекулярной биологии и медицине. В случае их использования в качестве лекарства его название оканчивается на -mab (от английского «monoclonal antibody»)

Наиболее широко используются моноклональные антитела в медицинской диагностике. Разработаны сумки-укладки для постановки диагнозов. Если к антителами присоединить радиоактивные или магнитоактивные материалы и ввести их в живой организм, то можно выявить в нем патологические зоны. Такие МКА присоединяются к пораженным болезнью клеткам организма, а соответствующие индикаторные материалы позволяют выяснить их местонахождение.

Методы иммуноферментного анализа применяют в диагностике вирусных заболеваний растений. Это позволяет сократить время получения безвирусного посадочного материала, отбирать новые вирусоустойчивые сорта. При генно-инженерных экспериментах можно быстро отбирать клоны - продуценты.

Методы анализа: иммуноферментный (ИФА), иммунолюминесцентный, иммунорадиологический

Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для идентификации различных веществ, будь то макромолекулы, клеточные фрагменты или целые клетки.

Начало широкому использованию антител в диагностических целях положил в 1955 году американский иммунолог А. Кунс. Он присоединил к антителам светящийся краситель. Флюоресцирующие антитела сделали видимыми места расположения интересующих его молекул в клетке. Этот метод получил название иммунофлюоресцентного. Чувствительность метода можно повысить несколькими путями. В первом случае иммунный ответ усиливается за счет применения антител нескольких порядков:

Антиген иммобилизуется на подложке, к нему добавляются антитела 1-го порядка, связывающиеся непосредственно с антигеном. В исследуемый образец добавляются антитела 2-го порядка, связывающиеся с антигенными детерминантами антител 1-го порядка. Антитела 2-го порядка имеют флюоресцирующую (или другую) метку. Поскольку участков связывания может быть несколько, то реакция проявляется более отчетливо. Другая система усиления сигнала основана на высоком сродстве биотина (низкомолекулярного растворимого витамина) к стрептавидину (бактериальному белку). Здесь возможны два варианта: А. Если возможно ковалентно связать биотин непосредственно с антителами, то стрептавидин метят маркером и используют аналогично антителам второго порядка:

Б. Система “биотин-антитело + стрептавидин + меченый биотин”:

В этом случае образуется целая сеть из молекул стрептавидина, связанного с меченым биотином. Следовательно, происходит многократное усиление сигнала. Применение антител второго и третьего порядков позволяет также упрощать процедуру определения микроорганизмов в мазке. При этом не обязательно иметь меченые антитела против всех бактерий. Достаточно иметь обычные антитела кролика или мыши против интересующего микроорганизма и меченые МКА против этих иммуноглобулинов. Если микроорганизм в мазке присутствует, то к нему “приклеятся” специфические антитела, а к ним уже - меченые. В результате мазок будет светится при люминесцентной микроскопии. Фотометрические или флуоресцентные методы могут быть использованы не во всех случаях, например, если измерение проводят очень мутной среде. Кроме красителя в качестве метки можно использовать фермент (иммуноферментный анализ) или радиоактивный изотоп (иммунорадиологический). От чувствительности детекции маркера зависит чувствительность метода анализа.