Методики культивирования одиночных растительных клеток

Отдельные клетки культивируют для получения клонов, изучения их генетической и физиологической изменчивости или стабильности. Отдельные клетки также важны для клоновой селекции мутантных, гибридных и трансформированных линий. Выращивание изолированных клеток складывается из двух этапов: 1) изолирование неповрежденной клетки растительной или каллусной ткани; 2) создание условий, благоприятных для роста и развития изолированной клетки.

На первом этапе необходимо выделить неповрежденную и жизнеспособную клетку из ткани целого растения или каллусной ткани. Лучше получать отдельные клетки из суспензионных культур или рыхлого каллуса. Идеальными отдельными клетками являются протопласты, образовавшие клеточную стенку.

Далее клетки изолируют либо при помощи микроманипуляторов, либо путем ряда последовательных разведений. При первых же попытках культивирования отдельных клеток возникла важная научная проблема: как заставить делиться клетки, изолированные от влияния других клеток популяции или тканей? Отдельные клетки вели себя иначе, чем их скопления в виде агрегатов в суспензии или каллусной массы на поверхности питательной среды.

При ее решении возникла гипотеза о «факторе кондиционирования». Так было названо вещество, стимулирующее деление отдельных клеток. Определено, что этот фактор имеет химическую природу, термолабилен, водорастворим, низкомолекулярен, видонеспецифичен, не заменяет известные фитогормоны, синергичен с брассиностероидами. Было предложено несколько вариантов культивирования отдельных клеток.

Впервые подобрать условия, подходящие для деления отдельных клеток, удалось в 1954 году Мьюиру, Хильденбранту и Райкеру. Этот способ получил название метода «ткани – няньки»

Рис. 12. Схема использования каллуса в качестве «ткани - няньки»

 Клетку изолируют при помощи микроманипулятора из рыхлого каллуса непосредственно на кусочек фильтра размером 8 * 8 мм, помещенный на верхушку каллусной ткани, из которой была взята клетка. Каллус должен находится в фазе активного роста. Можно также в качестве «няньки» использовать каллусную ткань другого растения родственного вида. В этом случае клетки растут и делятся. По мере старения каллуса – няньки фильтр с клетками переносится на молодой каллус. Когда ткань из клетки достигает размеров 0,5 – 1 мм, то ее можно высаживать непосредственно на питательную среду.

Проводились также эксперименты по высаживанию клетки непосредственно на агаризованную среду, но обязательно рядом с фильтром, который в течение нескольких дней контактировал с молодой, интенсивно растущей каллусной тканью. Поскольку эти работы показали, что постоянный контакт клетки через фильтр с каллусной массой не является обязательным для деления клетки, то было предложено использовать старую культуральную среду для стимуляции одиночной клетки к делению.

 Можно также использовать метод «кормящего слоя». Для этого берут суспензию клеток того же вида, что и одиночная клетка, или близкого вида. Клеточная суспензия должна находиться в ранней экспоненциальной фазе ростового цикла. В 1959 году Бергман предложил фильтровать суспензионную культуру (в его экспериментах это были табак и фасоль) стерильно через один слой батиста (ячейки 0,3 * 0,1 мм). В результате получали суспензию, на 90% состоящую из отдельных клеток. Эту суспензию смешивали с агаризованной питательной средой того же состава, что использовался при культивировании суспензии (среда содержала 0,6% агара). Смесь разливали тонким слоем (1 мм) в чашки Петри. Агар разделял клетки, но не препятствовал обмену химическими сигналами между ними, а толщина слоя позволяла смотреть за их поведением под микроскопом.

Индукция делений отдельных клеток возможна при применении очень богатой питательной среды, например, среды Као и Михайлюка. При этом объем среды, в которую помещаются клетки, должен был минимальным (микрокапли объемом до 20 мкл).

Все эти способы культивирования позволяют клетке «ощущать» фактор кондиционирования. Он либо вырабатывается в достаточном количестве клетками «кормящего слоя», «ткани – няньки», либо содержится в суспензии, где ранее культивировались клетки, либо не теряется в большом объеме среды. Таким образом, фактор, вызывающий деление клеток, вырабатывается самими клетками, но в небольшом количестве. И только увеличивая число клеток, вырабатывающих этот фактор, чтобы он не рассеивался в больших объемах питательной среды, или же уменьшая объем среды, в котором будет выращиваться клетка, можно заставить ее делиться.

Билет 8

2. Вектор – молекула ДНК, способная переносить в клетку чужеродную ДНК и обеспечивать там ее размножение (клонирование) или реже – включение в геном. К векторам предъявляются определенные требования. Кольцевая молекула ДНК может реплицироваться в клетках, если содержит ДНК-репликатор(оri-последовательность). Вектор должен содержать уникальные сайты рестрикации для нескольких рестриктаз, обладать определенной емкостью и не выбрасывать встроенный фрагмент;маркерный ген, облегчающий отбор клеток, несущих вектор,чтобы ген экспрессировался (получался продукт, синтезированный по информации введенного гена); специфические для данной клетки промоторы и терминаторы («стоп»-кодоны) транскрипции. Любая молекула ДНК, обладающая данными свойствами, может использоваться как вектор.На самом деле, реальные векторы должны обладать еще целым рядом свойств в зависимости от целей их применения. Так, очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чужеродной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинактные молекулы. Удобно работать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молекула должна иметь как можно больше единичных последовательностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обеспечиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. coli. В этом случае используется четыре типа векторов: 1) плазмиды; 2) бактериофаг .; 3) производные бактериофага , (космиды и фазмиды)*; 4) бактериофаг М13. Существуют различные типы векторов с разными свойствами. Если имеется в виду “клонирующий вектор”, т.е. такой, который обеспечивает репликацию (размножение) выделенного гена в клетке, то от него требуется: во-первых, наличие ограниченного количества (предпочтительно одного) мест расщепления определенной рестриктазой; во-вторых, он должен нести какой-либо генетический маркер, который позволит отобрать векторы, содержащие клонированный ген, в-третьих, он не должен терять “жизнеспособность”, т.е. способность реплицироваться при встройке в него чужих фрагментов ДНК. В случае вектора, обеспечивающего встраивание чужеродной ДНК в геном клетки, говорят об “интегративном векторе”. Если вектор способен “жить” (реплицироваться) в клетках разных организмов, например, в  бактериях и дрожжах, говорят о “бинарном векторе ”.

3. Клеточная инженерия – это одно из наиболее важных на-

правлений в биотехнологии.

клеточная инженерия в большей степени

изучает растительные клетки и ткани, поскольку клетки растений способны к регенерации и обладают уникальным свойством– тотипотентностью, т.е. способностью образовывать целое рас-

тений от одной исходной клетки. Кроме того, каждая клетка

растения сохраняет все необходимые хозяйственно-полезные

свойства материнского организма, в результате чего все искусственно полученные особи являются копией материнской.На современном этапе сложились 3 основных направления

клеточной инженерии растений:

1. Оздоровление и размножение генетически ценных растений, при котором при культивировании in vitro переносчики

систем болезней полностью устраняются, поэтому этот метод

оказывается очень удобными для быстрого размножения и хранения растений, которые были поражены заболеваниями, особенно вирусными. В целом от одной меристемы можно полу-

чить сотни тысяч растений в год.

Кроме того, данный способ позволяет значительно сократить период вегетативного развития культивируемых растений.

Так, вегетационный период груши в лабораторных условиях сократился с 25 лет до 4 лет.

2. Получение от культивируемых каллусных тканей веществ вторичного синтеза, которые используются в медицине,

парфюмерии, косметике и других отраслях промышленности.

Это алколойды, стеройды, гликозиды, гормоны, эфирные масла

и др. Например, для медицины получают такие препараты, как

болеутоляющее вещество кодеин из мака снотворного; дигоксин, тонизирующий сердечную деятельность – из наперстянки;стимулятор – кофеин – из растений чая и кофе; тонизирующие

вещества – из клеток женьшеня и др.

3. Криосохранение диких видов растений с целью обеспечения притока генов диких растений селекционируемым сельскохозяйственным сортам.

В зависимости от цели использования растительных клеток

и тканей применяется 2 метода культивирования:

1) вегетативное клонирование растений (метод микроразмножения);

2) культивирование каллусных тканей.Таким образом, роль культуры клеток и тканей огромна, а

способы их культивирования являются мощным инструментом

расширения возможностей селекционной работы.

Схема клонального микроразмножения растений

методом активации развития существующих меристем (1-й путь)

и индукции возникновения адвентивных почек на экспланте (2-й путь):

1 – выбор исходного экспланта; 2 – получение стерильной культуры;

3 – образование адвентивных почек непосредственно на первичном

экспланте; 4 – рост почек и формирование микропобегов; 5 – размножение микропобегов (черенкование); 6 – укоренение микропобегов;

7 – депонирование растений-регенерантов при пониженной температуре; 8 – перевод растений в тепличные условия; 9 – высадка растений-регенерантов в грунт

Для чего создают ГМ-растения (трансгенные растения)?

Устойчивость к гербицидам позволяет трансгенному растению быть невосприимчивым к смертельным для других дозам химикатов. В результате поле очищается от сорняков, а культуры, толерантные к гербицидам, выживают.

Чаще всего компания, продающая семена подобных растений, предлагает в наборе и соответствующие гербициды

Устойчивость к насекомым позволяет существенно уменьшить потери урожая от насекомых-вредителей. Например, колорадский жук, съедая лист ГМ- картофеля, погибает. Почти все такие растения содержат встроенный ген природного токсина земляной бактерии Bacillus thuringiensis (Bt-ген).

Устойчивость к патогенам – грибам, бактериям и вирусам, например, за счет генов хитиназ или  генов белков оболочки вирусов.

Качество продукции (улучшенный соевый белок, рапсовое масло с низким содержанием эруковой кислоты, тополь без «пуха», лесные культуры)

Зеленые вакцины и лекарства (гепатит В, Гепатит С, бананы с введенным анальгином и т.д.)

Билет 9 1. Гено́мика — раздел молекулярной генетики, посвященный изучению генома и генов живых организмов. Проект Геном Человека (ПГЧ), ставящий задачу картировать полный набор человеческих генов, представляет собой попытку релокализации и онтологической реструктуризации сферы современной медицины и, как последствие, создание новых точек приложения медицинского действия. Большое число патологий человека уже нашло себе место в различных регионах ДНК. Этот онтологический сдвиг генерирует мощные ресурсы для стимулирования глубокого и интенсивного желания лечения, нацеленного на вторжение в человеческий геном. Он создает новые шансы для человека – не потерять последнюю надежду, столкнувшись с угрозой рака, СПИДа, старения, криминального поведения и даже непослушания собственных детей, превратив эту педагогическую проблему в медицинскую (генетическую), например, связанную с генетически детерминированным дефицитом внимания. Успешное окончание первой части ПГЧ – завершение описания нуклеотидных последовательностей, образующих геном, – было объявлено в июне 2000 года. На следующей стадии ученые должны открыть, локализовать и дать функциональное описание всех генов человека.

В целом ошеломляющие достижения ПГЧ сулят современным профессионалам в области биомедицины громадную власть, заключающуюся в контроле над производством людей с желаемыми качествами.

Успехи геномики (и генной инженерии) позволяют выявлять гены, необходимые патогену при его размножении только в инфицированном организме и вести затем поиск ингибиторов функций их продуктов. Так, с недавнего времени получила известность система "In Vivo Expression Technology" (IVET), используемая для отбора генов вирулентности (ivi гены) Геном исследуемого патогена фрагментируется с помощью набора рестриктаз: в отдельных фрагментах оказываются или ivi гены, или "жизненно важные" гены. Последние необходимы клетке для ее роста и in vivo, и in vitro. ivi гены: они не необходимы бактерии при росте на обыденных искусственных питательных средах, потому in vitro оказываются скрытыми.

Ингибиторы их функций могут быть выявлены и на искусственной питательной среде, то есть известными путями. Гены же вирулентности, мало изученные вообще, представляют, как мишени для химиотерапевтического агента, особый интерес, поскольку патоген, потерявший вирулентность, будет быстро уничтожаться защитными силами организма.

Система IVET, основанная на захвате промотора тех генов, которые экспрессируются только in vivo, позволила обнаружить, например, у сальмонелл примерно 1% таких генов. Системы обнаружения ivi генов, основанные на разных подходах, разрабатываются в разных лабораториях. В число генов вирулентности входят не только гены, кодирующие образование адгезинов, инвазинов и т. п., но и гены, позволяющие микроорганизму переносить дефицит необходимых веществ в макроорганизме, например, гены системы транспорта железа, реутилизации пуринов.

2,Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.

Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, репарации повреждений (восстановлению целостности молекулы), в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.

Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:

- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);

- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);

- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);

- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

 Рестриктазы

Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонуклеазы рестрикции) - это ферменты, узнающие и атакующие определенные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК (сайты рестрикции).

Лигазы

ДНК-лигаза. Он катализирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-х цепочечной молекуле нуклеиновой кислоты.

Иными словами, ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды, образуя связь между остатками сахаров. ДНК-лигазы абсолютно необходимы в процессах репарации ДНК, в процессах репликации - при удвоении цепи ДНК.

ПРИНЦИПЫ ТЕХНОЛОГИЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ

ДНК.Было выделено много рестриктаз(более 150),расщепляющих ДНК в специфическихсайтах. Например эндонуклеаза R1 регистрирует двухцепочную ДНК по двумсайтам таким образом, что образуются два липких конца

­Липкие концы различных молекул ДНК, расщеплённых этим ферментом, могут

вступать по четырём –A-T-парам. Рестриктационные эндонуклеазы различаются потем сайтам ДНК, которые они распознают и разрезают. Их можно использовать

для различных целей. Однако наиболее распространенным этапом является их

применение для амплификации специфической определения нуклеотидных

последовательностей фрагментов ДНК, необходимо для ДНК или для изучения

механизмов экспрессии генов. Последняя проблема наиболее важна в практическом

аспекте: гены контролирующие образование функционально активных белков,

теперьможно вводить в бактерии и размножать(амплифицировать).эта процедура

называется клонированием генов. Благодаря ей, появилась возможность

вырабатывать в больших количествах белки, которые раньше удавалось получить

ничтожно мало. Эта технология основана на следующем принцепе: помимо своей

собственной кольцевой хромосомы, бактерии часто содержат дополнительные

маленькие кольцевидные молекулы двух цепочной ДНК,называемые плазмидами.