2,, Плазмиды — дополнительные факторы наследственности, расположенные в клетках вне хромосом и представляющие собой кольцевые (замкнутые) или линейные молекулы днк.

Плазмиды способны удваиваться (реплицироваться) автономно, но при этом они эксплуатируют репликационную систему клетки хозяина. Большинство плазмид кодирует специальные белки — инициаторы репликации. Эти белки начинают процесс репликации, который затем подхватывается и продолжается репликационной системой клетки.

Плазмиды широко используются в генной инженерии для переноса генетической информации и генетических манипуляций. Для этого создаются искусственные плазмиды — векторы, состоящие из частей, взятых из разных генетических источников, а также из искусственно созданных фрагментов ДНК. пособность П. быстро копироваться и передаваться из клетки в клетку при внутривидовой, межвидовой и межродовой конъюгации бактерий определяет важную роль плазмид в эволюции этих организмовИх используют для получения в промышленных масштабах биологически активных белков — ферментов, гормона роста, инсулина и др. Способность многих П. выполнять роль половых факторов бактерий дает возможность применять их для экспериментального получения различных гибридных форм и генетического картирования этих организмов. Плазмидные векторы используются чаще всего для размно-жения (клонирования) гена. Из генома фага вырезают его собственную ДНК, остав-

ляя концевые фрагменты фага неизменными, так как они необ-

ходимы для репликации и упаковки ДНК в головку фага (cos-

сайты).Для клонирования и переноса более крупных фрагментов

ДНК (30-45 т.н.п.) были сконструированы искусственные векторы – космиды, содержащие cos-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в голову фага λ и специальные по-

следовательности (ori-сайт), позволяющие им реплицироваться

по плазмидному типу.

Космидами трансформируют клетки E. coli, где они размно-

жаются как плазмиды, и каждая фаговая частица вызывает обра-

зование колонии индивидуального бактериального трансфор-

манта.Космиды представляют собой небольшие плазмиды, в которые in vitro введены cos-сайты ДНК фага лямбда . Космиды – плазмидные вектора, в которые встроен участок генома фага λ, обеспечивающий возможность упаковки этой молекулы ДНК в фаговую частицу. Фаговые частицы обеспечивают хорошее проникновение гибридной ДНК в клетку (путем инъекции), после чего происходит замыкание ДНК в кольцо по липким концам и репликация ее по плазмидному типу.

3. Выделяют два типа культивируемых растительных клеток: нормальные и опухолевые.

опухолевые клетки делятся и растут на питательных средах без добавок фитогормонов. Эти клетки также лишены способности дать начало нормально организованным структурам (корни, побеги) в процессе органогенеза.Нормальные клетки в культуре могут существовать в двух видах: в виде суспензии в жидкой питательной среде и на поверхности твердой питательной среды в виде каллуса. Поверхностное культивирование осуществляют на полужидкой агаризованной среде, среде с добавлением других желирующих полимеров, на дисках из полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупогруженных в жидкую питательную среду. Каллусная ткань, выращиваемая поверхностным способом, представляет собой аморфную массу тонкостенных паренхимных клеток, не имеющую строго определенной анатомической структуры. Цвет массы может быть белым, желтоватым, зеленым, красным. В зависимости от происхождения и условий выращивания каллусные ткани бывают:

- рыхлые, сильно оводненные, легко распадающиеся на отдельные клетки;

- средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;

- плотные, с зонами редуцированного камбия и сосудов. Как правило, в длительной культуре на средах, содержащих ауксины, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми.Суспензионные культуры

отдельные клетки или группы клеток, выращиваемые во взвешенном состоянии в жидкой среде. Представляют собой относительно гомогенную популяцию клеток, которую легко подвергнуть воздействию химических веществ.

Клеточную суспензию получают, помещая каллусную ткань в колбу с жидкой питательной средой. Суспензия перемешивается в колбе на качалке, имеющей скорость перемешивания 100 - 120 об/мин. При первом переносе на свежую среду удаляют крупные кусочки исходного каллуса и крупные агрегаты, фильтруя через 1 - 2 слоя марли, нейлоновые сита, шприц с соответствующим отверстием. Для инициализации суспензионной культуры необходимо 2 - 3 г свежей массы каллусной культуры на 60 - 100 мл жидкой питательной среды. Рост суспензионных культур клеток ростовые кривые, которые имеютS-образную форму и состоят из нескольких участков: 1- латентная, или лаг-фаза, где видимый рост не наблюдается ни по одному из критериев; 2 - экспоненциальная, рост с ускорением; 3 - линейная, где скорость роста постоянна; 4 - фаза замедленного роста; 5 - стационарная фаза; 6 - фаза деградации клеток (рис. 11).

Отличительная особенность суспензионных культур клеток растений — высокая плотность, необходимая для роста. Периодическое, или накопительное, культивирование — это самый простой способ выращивания клеток, являющийся пока традиционным. Суспензионные культуры используют для промышленного получения вторичных метаболитов. Вещества, продуцируемые растительными клетками используются в медицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и других отраслях промышленности. К ним относятся: алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, полифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антиканцерогены (птотецин, харрингтонин), пептиды (ингибиторы фитовирусов). В настоящее время в разных странах около ста видов растений используется в биосинтетической промышленности для получения экономически важных веществ, среди них — женьшень, раувольфия змеиная, наперстянка шерстистая и пурпурная, диоскорея дельтовидная, воробейник, беладонна, паслен дольчатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина, агава, мак снотворный и др.

Получение вторичных метаболитов имеет свои особенности. Деление клеток, приводящее к увеличению клеточной биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Накопление вторичных метаболитов возрастает в фазе замедленного роста клеточной популяции и достигает максимума в стационарной фазе. Некоторые алкалоиды активно синтезируются в фазе максимальной митотической активности (экспоненциальный рост), что является исключением. Механизмы и условия, блокирующие активный рост клеток и клеточную пролиферацию, одновременно активируют ферменты вторичного метаболизма. Неспецифические стрессовые условия, воздействующие на клетки в конце экспоненциальной фазы, могут стимулировать переход к синтезу вторичных метаболитов и увеличивать их выход. Необходимо учитывать, что вопрос взаимодействия первичного и вторичного метаболизма, рассмотренный нами в упрощенном виде, намного сложнее.