Розділ 2. Матеріали та методи

Об’єктом дослідження були фуражирні бджоли Apis mellifera, що були привезені з експериментальної пасіки ЧНУ. Для дослідження відбирали робочих бджіл з контрольних (без підгодівлі) та дослідних колоній (сім'ї підгодовували протягом 3-х днів 60% розчином сахарози) в три етапи: I – перед початком досліду (нульовий день), II – на 4-й день, (наступний після припинення підгодівлі) та III – 11-й день експерименту (7-й день після припинення підгодівлі).

2.1 Методика підготовки тканин імаго бджоли медоносної a.Mellifera до вимірювання активності ферментів

1. Бджіл привозили з пасіки та поміщали у садок. Садок поміщають у термостат із температурою 22-23 ̊̊ С.

2. Після цього, безпосередньо у день проведення експерименту, бджіл у садку поміщають у холодильник на 10-15 хв, для припинення активності.

3. Надалі бджіл виймають із холодильника, і відбирають пінцетом, при цьому притискаючи груди бджоли (до характерного легкого хрусту), за рахунок чого вона знерухомлюється [6].

4. Для виготовлення супернатанту, який використовується для вимірювання активності асккорбатпероксидази (APX) відбираємо кишечники з шлуночками, голови та торакси з 10 бжіл, а як буферний розчин використовували 100мМ NaPH (pH 7.0), який містив 2,5мМ аскорбат [28].

5. Після того як бджолу знерухомили, її кладуть боком на стіл, злегка притискаючи пінцетом. Другим пінцетом у цей час відділяють останній жалоносний сегмент черевця, і разом із ним витягають із бджоли кишечник та шлунок.

6. Далі бджоли без шлуночків та кишечників переміщують у пробірки та занурюють в рідкий азот.

7. Кожен витягнутий кишечник та шлунок очищується від грубих неперетравлених залишків, після чого поміщається у епендорф із буфером для кишечників та шлунків.

8. Далі епендорф із буфером, в якому знаходяться шлунки та кишечники центрифугують 10-15 хвилин при 350 G, для остаточного очищення матеріалу.

9. Відбирають рідину з епендорфу, та зважують наважку кишечників із шлунками.

10. Із бджіл, що були занурені в рідкий азот, відчленовуються говолови та торакси за допомогою пінцета і поміщаються у епендорфи.

11. Далі кишечники із шлунками, голови та торакси гомогенізують, додаючи у 5 разів більший об’єм NaPH буфера.

12. Після цього розчини кишечників із шлунками, голів та тораксів центрифугують 10 хвилин при 12000 g.

13. Відбирають супернатант у чисті епендорфи, і поміщають у холодильник, або зразу вимірюють активність ферментів.

2.2 Вимірювання активності apx

Вимірювання проводять у день проведення досліду, так як під час зберігання екстракту ферменти змінюють свою активність.

1. Готується реакційний буфер (для визначення активності APX).

Для визначення активності APX у тканинах шлунка + кишечника, голови та грудей (50 мл буферу) [13, 28]:

• 5 мл 1M NaPH

• 125 мкл 1M AsA

• 1500 мкл 1M H₂O₂

• 43,375 мл H₂O

3. Усі реактиви слід постійно тримати у охолодженому штативі. Якщо не виконується робота із екстрактами, їх слід помістити у холодильну камеру.

4. Вимірювання проводиться за допомогою спектрофотометра (СФ-46). Обов’язково вмикають прилад за 15-20 хвилин до роботи із ним. Довжина хвилі для вимірювання активності APX – 290 нм.

5. У одну кювету додається 1 мл приготовленого заздалегідь реакційного буфера. У другу кювету додають кількість буферу, яка залежить від кількості взятого екстракту (разом 1 мл). Кювети поміщаються у прилад. Далі його налаштовують до отримання оптимальних значень. Перед вимірюванням у дослідну кювету додають екстракт та 100 мкл аскорбату і добре перемішують суміш у кюветі. Перед додаванням екстракту засікають час. Перемішують до 7 секунд, після чого швидко закривають прилад, та відкривають шторку приладу. Вимірюють перше значення на 10 секунді. Надалі фіксують значення кожні 30 секунд.

6. Активність аскорбатпероксидази вимірювалась як мкМ окисленого аскорбату на хвилину на мг білку використовуючи коефіцієнт екстинції 2,8 мМ-1 * см-1 [12, 28].