23. Химический состав нуклеиновых кислот
В молекуле ДНК углевод представлен дезоксирибозой, а в молекуле РНК – рибозой, отсюда их названия: дезоксирибонуклеиновая (ДНК) и рибонуклеиновая (РНК) кислоты. Кроме того, они содержат фосфорную кислоту, по два пуриновых(А,Г) и по два пиримидиновых основания(Ц,Т,У); различия только в пиримидиновых основаниях: в ДНК содержится тимин, а в РНК –урацил.
В составе нуклеиновых кислот встречаются три главных пиримидиновых основания: цитозин, урацил и тимин.
Помимо главных пиримидиновых оснований, в составе нуклеиновых кислот открыты минорные пиримидиновые основания, 5-метил- и 5-оксиметилцитозин, дигидроурацил. Два пуриновых основания, постоянно встречающихся в гидролизатах нуклеиновых кислот, имеют следующее строение:
Аденин Гуанин
К минорным нуклеозидам пуринового ряда, обнаруживаемым в составе ДНК и РНК, относятся инозин. Cвойство свободных азотистых оснований –существование в двух таутомерных формах, в частности лактим- и лактамной формах. В составе нуклеиновых кислот все оксипроизводные пуринов и пиримидинов находятся в лактамной форме.
Содержание ДНК в клетках постоянно и исчисляется несколькими пикограммами. На долю РНК приходится около 5–10% от общей массы клетки Выделяют три главных вида
РНК: матричную (информационную) – мРНК, РНК; рибосомную – рРНК, и транс-
портную – тРНК. СТРУКТУРА НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Правило Э. Чаргаффа.
1) молярная доля пуринов равна молярной доле пиримидинов:
2) количество аденина и цитозина равно количеству гуанина и тимина:
3) количество аденина равно количеству тимина, а количество гуанина равно количеству цитозина: А = Т и Г = Ц; соответственно
4) существенным для характеристики вида (таксономическое значение) оказался так называемый коэффициент специфичности, отражающий отношение
Структурными единицами нуклеиновых кислот являются мономерные молекулы – мононуклеотиды. . Это продукты полимеризации мононуклеотидов, число и последовательность расположения которых в цепях ДНК и РНК определяются в строгом соответствии с программой, заложенной в молекуле матрицы . Мононуклеотиды состоят из трех специфических компонентов: азотистого основания, углевода и фосфорной кислоты. Соединения азотистого основания и углевода -нуклеозид. Нуклеозиды содержат пуриновое или пиримидиновое основание, соединенное с углеводом N-гликозидной связью. Мононуклеотиды, присоединяя еще один остаток фосфата, образуют фосфоангидридную связь и превращаются в нуклеозиддифосфаты (АДФ, ГДФ, УДФ, ЦДФ и ТДФ). Писоединяя еще один остаток фосфата, образуют нуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ,УТФ, ЦТФ и ТТФ). Функция нуклеозидтрифосфатов - участие в биоэнергетике всех живых организмов. В организме существкет два типа фосфорных эфиров нуклеотидов:1. когда фосфат связывает 2 атома кислорода пентозного остатка в одном и том же нуклеотиде 2.когда фосфатный мостик объединяет два разных мононуклеотида. Первичная структура нуклеиновых кислот Под первичной структурой нуклеиновых кислот понимают порядок, последовательностьрасположения мононуклеотидов в полинуклеотидной цепи ДНК и РНК. Такая цепь стабилизируется 3',5'-фосфодиэфирными связями. К настоящему времени удалось определить первичную структуру почти всех тРНК, ряда молекул 5S рРНК, 16S рРНК E.coli, вирусных РНК, в состав которых входят сотни и тысячи нуклеотидных остатков. Все клеточные РНК в основном состоят из одноцепочечной полинуклеотидной цепи: 5'-Г–У–Г–Ц–А–А–...–У–Ц–Г–Ц–Ц–А–3' Полинуклеотидная цепь молекулы РНК имеет на одном конце свободный монофосфорный эфир,на противоположном конце цепи такой фосфат отсутствует, а содержится нуклеотид со свободными 2'- и 3'-гидроксильными группами. О первичной структуре ДНК судят по распределению минорных оснований и обнаружению в ДНК и определению последовательности палиндромов. Вторичная структура нуклеиновых кислот В соответствии с моделью Дж. Уотсона и Ф. Крика, предложенной в 1953 г. молекула ДНК состоит из двух цепей, образуя правовращающую спираль, в которую обе полинуклеотидные цепи закручены вокруг одной и той же оси. Удерживаются цепи благодаря водородным связям, образующимся между их азотистыми основаниями. Обе цепи поли нуклеотидов в биспиральной молекуле ДНК имеют строго определенное пространственное расположение, при котором азотистые основания находятся внутри, а фосфорильные и углеводные компоненты – снаружи. В биспиральной молекуле ДНК основания уложены парами: пурин из одной цепи и пиримидин из другой в соответствии с правилами Чаргаффа (пары аденин–тимин и гуанин–цитозин). Избирательность взаимодействия пар А–Т и Г–Ц принято выражать термином «комплементарность», а соответствующие азотистые основания называют комплементарными. Стабильность А–Т оснований обеспечивается двумя водородными связями, а пар Г–Ц – тремя. Обе цепи в молекуле ДНК имеют противоположную полярность. Конфигурация двойной спирали ДНК сильно меняется в зависимости от количественного содержания воды и ионной силы окружающей среды. Существовует 6 форм ДНК, названных А-, В-, С-, D-, Е- и Z-формами. Третичная структура нуклеиновых кислот Двойная спираль ДНК на
некоторых участках может подвергаться дальнейшей спирализации с образованием суперспирали или открытой кольцевой формы Суперспиральная структура обеспечивает экономную упаковкуогромной молекулы ДНК в хромосоме. Суперспирализация ДНК может быть нарушена разрывом в одной из цепей или в обеих цепях двойной спирали под действием ДНКазы или при обработке интеркалирующими соединениями. Нативные молекулы тРНК имеют примерно одинаковую третичную структуру, которая отличается от плоской структуры «клеверного листа» большой компактностью за счет складывания различных частей молекулы
26 а. Репликации-образование дочерних молекул ДНК, первичная структура которых идентична родительской ДНК (копирование ДНК). Репликация ДНК является ключевой функцией делящейся клетки и частью таких биологических процессов, как рекомбинация, транспозиция и репарация
В репликации ДНК выделяют: 1. узнавание точки начала процесса2. расплетение родительских цепей ДНК в репликационной вилке 3. инициацию биосинтеза дочерних цепей 4.элонгацию 5.окончание (терминация) .Участвует более 40 ферментов и белковых факторов, объединенных в единую ДНК-репликазную систему, называемую реплисомой. В стадии инициации ферментом является РНК-полимераза( праймаза), которая катализирует синтез праймера, с которого начинается синтез ДНК. Основным ферментоми в стадии элонгации является ДНК-полимераза III, ДНК-полимеразы I, ДНК-полимеразы II. Фермент – ДНК-лигаза, катализирующая за счет энергии АТФ. Функцию раскручивания (расплетения) двойной спирали ДНК в репликационной вилке, происходящего за счет энергии гидролиза АТФ, выполняет специфический rep-белок, названный хеликазой. Образовавшиеся на определенное время одноцепочечные участки ДНК служат в качестве матрицы при репликации и стабилизируются при помощи особых белков, связывающихся с одноцепочечной ДНК (ДНК-связывающие белки) и препятствующих обратному комплементарному взаимодействию цепей. Имеются, кроме того, особые ферменты топоизомеразы, обеспечивают как репликацию, так и транскрипцию ДНК. В репликации ДНК эукариот участвуют два главных типа полимераз – α и δ .ДНК-полимераза δ состоит из 2 субъединиц Этапы биосинтеза ДНК. Механизм синтеза ДНК у Е. coli может быть подразделен на три
этапа; инициацию, т.е. начало, элонгацию, т.е. продолжение, и терминацию, т.е. завершение (прекращение) синтеза. Каждый из этих этапов требует участия специфических ферментов и белковых факторов. Этап I – инициация биосинтеза ДНК – является началом синтеза дочерних нуклеотидных цепей; в инициации участвует минимум восемь хорошо изученных и разных ферментов и белков. Первая фаза – это, как указано ранее, ферментативный биосинтез на матрице ДНК необычного затравочного олигорибонуклеотида (праймера) со свободной гидроксильной группой у С-3' рибозы. При инициации к цепям ДНК последовательно присоединяются ДНК-раскручивающие и ДНК-связывающие белки, а затем комплексы ДНК-полимераз и праймаз. Этап II – элонгация синтеза ДНК – включает два кажущихся одинаковыми, но резко различающихся по механизму синтеза лидирующей и отстающей цепей на обеих материнских цепях ДНК. Синтез лидирующей цепи начинается с синтеза праймера (при участии праймазы) у точки начала репликации, затем к праймеру присоединяются дезоксирибонуклеотиды под действием ДНК-полимеразы III; далее синтез протекает непрерывно, следуя шагу репликационной вилки. Синтез отстающей цепи, напротив, протекает в направлении, обратном движению репликационной вилки и начинается фрагментарно. Фрагменты всякий раз синтезируются раздельно, начиная с синтеза праймера, который может переноситься с готового фрагмента при помощи одного из белковых факторов репликации в точку старта биосинтеза последующего фрагмента противоположно направлению синтеза фрагментов. Элонгация завершается отделением олигорибонуклеотидных праймеров, объединением отдельных фрагментов ДНК при помощи ДНК-лигаз и формированием дочерней цепи ДНК Этап III – терминация синтеза ДНК – наступает, скорее всего, когда исчерпана ДНК-матрица и трансферазные реакции прекращаются. Точность репликации ДНК чрезвычайно высока, возможна одна ошибка на 1010 трансферазных реакций, однако подобная ошибка обычно легко исправляется за счет процессов репарации. Выдающимся достижением биохимии нуклеиновых кислот является открытие в составе онковирусов фермента обратной транскриптазы, или ревертазы (РНК-зависимая ДНК-полимераза), катализирующего биосинтез молекулы ДНК на матрице РНК .Типы репликации:1.Консервативный.Новая молекула ДНК не содержит материнских нитей. 2.Полуконсервативный. .Новая молекула ДНК содержит одну часть материнской и одну часть синтезируемой. 3.Дисперсивный.Материал исходной молекулы случайно распределяется в дочерних.
26 б. Транскрипция
– биосинтез матричных РНК на молекуле ДНК, и процесс трансляции – биосинтез белка на мРНК. В синтезе участвует фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза которая осуществляет синтез от 5′к 3′ концу.На молекуле ДНК выделяют следующие элементы:промотор(участок в котором начинается транскрипция),транскриптон(участок в котором происходит транскрипция),терминатор (участок в котором завершается транскрипция). У эукариот в составе транскриптона обнаружен 1ген,у прокариот-несколько.Транскриптон у прокариот называется оперонам. Этапы транскрипции: 1.Инициация.Взаимодействие фермента РНК-полимеразы и ДНК приводит к образованию двойного закрытого комплекса,затем двойного открытого комплекса после расщепления ДНК.Затем образуется тройной открытый комплекс за счет фосфолипидных связей. 2.Элонгация.РНК-полимераза прочитывает информацию с транскриптона слева направо пока не достигнет терминирующего участка. 3.Терминация.РНК-полимераза покидает тройной открытый комплекс с образованием молекулы ДНК,РНК а сама катализирует следующую реакцию: nНТФ→(НМФ)n+ФФн РНК-полимераза у Е. coli состоит из двух одинаковых α-субъединиц , двух разных β (β1 и β2)-субъединиц, ω-субъединицы и σ-субъединицы. Последняя обеспечивает узнавание промотора для синтеза РНК. У эукариот открыты три разные РНК-полимеразы (I, II и III). РНК-полимераза I ответственна за синтез только рибосомных РНК (5,8S, 18S и 28S рРНК;. РНК-полимераза II – основной фермент, катализирующий синтез матричной РНК (мРНК). РНК-полимераза III катализирует преимущественно синтез транспортных РНК (тРНК), а также 5S рРНК инженерии.
27. рРНК Как известно, живые организмы в зависимости от структуры клеток делятся на две группы – прокариоты и эукариоты. Первые не содержат ограниченного мембраной ядра и митохондрий или хлоропластов; они представлены главным образом микроорганизмами. Клетки эукариот животных и растений, включая грибы, напротив, содержат ядра с мембранами,а также митохондрии (в ряде случаев и хлоропласты) и другие субклеточные органеллы. Химически рибосомы представляют собой нуклеопротеины, состоящие из РНК и белков, причем 80S (коэффициент седиментации при центрифугировании) рибосомы эукариот содержат примерно равное их количество, а у 70S рибосом прокариот соотношение РНК и белка составляет 65% и 35% соответственно. РНК рибосом принято называть рибосомными и обозначать рРНК. Как 80S, так и 70S рибосомы состоят из двух субчастиц. При этих условиях рибосомы диссоциируют на субчастицы; последние могут быть отделены друг от друга методом ультрацентрифугирования. Одна из субчастиц по размерам в 2 раза превышает вторую. Так, у 70S рибосом величины s для субчастиц равны 50S и 30S, у 80S рибосом – соответственно 60S и 40S. РНК 23S и 5S содержат 3200 и 120 нуклеотидов соответственно, a 16S РНК – 1540 нуклеотидов. Субчастицы рибосом клеток эукариот построены более сложно. В их составе четыре разные рРНК и более 70 разных белков в обеих субчастицах. При этом большая субчастица (60S) содержит три разного размера рРНК: 28S, 5,8S и 5S. Малая субчастица (40S) содержит всего одну молекулу 18S рРНК и около 33 белков. рРНК образуется из общего предшественника всех типов клеточных РНК, в свою очередь синтезирующегося на матрице ДНК в ядре. Рибосомные белки имеют цитоплазматическое происхождение, затем они транспортируются в ядрышки, где и происходит спонтанное образование рибосомных субчастиц путем объединения белков с соответствующими рРНК. Объединенные субчастицы вместе или врозь транспортируются через поры ядерной мембраны обратно в цитоплазму, где группа рибосом вместе с мРНК образует полисомы или полирибосомы, принимающие непосредственное участие в синтезе белка. Транспортные РНК К настоящему времени открыто более 60 различных тРНК. Для каждой аминокислоты в клетке имеется по крайней мере одна специфическая тРНК. В молекуле тРНК открыты спирализованные участки, необычные водородные связи и гидрофобные взаимодействия во внеспирализованных участках. Показано, что тРНК имеет псевдоуридиловую петлю, образованную из нуклеотидов, содержащих псевдоуридин (ТψС), и дигидроуридиловую петлю. Обе петли участвуют в образовании угла буквы L. На 3'-ОН-конце распо лагается одинаковая для всех тРНК последовательность триплета ЦЦАОН, к которой присоединяется посредством эфирной связи специфическая аминокислота. Связывание в основном происходит через 3'-ОН-группу концевого аденилового нуклеотида, хотя, как было указано, получены доказательства возможности предварительного присоединения аминокислоты и через его 2'-ОН-группу.В частности,псевдоуридиловая петля, по-видимому, обеспечивает связывание аминоацил-тРНК с рибосомой, а дигидроуридиловая петля, вероятнее всего,необходима как сайт (место) для узнавания специфическим ферментом –аминоацил-тРНК-синтетазой. Имеется, кроме того, добавочная петля,состав которой варьирует у разных типов молекул тРНК; ее назначение неизвестно. Существенным, с полностью раскрытой функцией участком является антикодоновая петля, несущая триплет, названный антикодоном, и расположенная на противоположной стороне от того конца, к которому присоединяется аминокислота. Антикодоновая петля состоит из 7 нуклеотидов: три занимают центральное положение и формируют собственный высокоспецифичный антикодон, по два нуклеотида расположены по обе стороны от него, включая модифицированный пурин и варьирующее основание с одной стороны и два пиримидиновых основания – с другой стороны. Антикодон является специфичным и комплементарным к соответствующему кодону мРНК, причем оба они антипараллельны в своей комплементарности. Матричная РНК Роль матричной РНК (мРНК), потому что ее роль заключается в переносе информации от ДНК в ядре (где она синтезируется под действием ДНК-зависимой РНК-полимеразы) до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой осуществляется синтез белка. При изучении влияния различных фракций клеточной РНК на способность рибосом, выделенных из Е. coli, к синтезу белка было установлено, что некоторые из них стимулировали включение 14С-аминокислот в синтезируемый полипептид. Последовательность нуклеотидов РНК реализуется в специфической последовательности аминокислот синтезируемой полипептидной цепи. Не рибосома и не рибосомная рРНК являются матрицей, на которой синтезируются специфические белки, а эту роль выполняют поступающие извне матричные РНК. Итак, ДНК передает информацию на РНК, которая синтезируется в ядре и затем поступает в цитоплазму; здесь РНК выполняет матричную функцию для синтеза специфической белковой молекулы. Матричная гипотеза белка, как и других полимерных молекул ДНК и РНК (см. ранее), в настоящее время получила подтверждение. Ее правомочность была доказана в экспериментах, которые обеспечивали точное воспроизведение первичной структуры полимерных молекул синтез в отличие от малоуправляемого химического синтеза отличался не только высокой скоростью и специфичностью, но и направленностью самого процесса в строгом соответствии с программой, записанной в линейной последовательности молекулы матрицы.