48. Отличие процесса транскрипции у про- и эукариот

РН-полимераза прокариот обеспечивает транскрипцию генов, несущих информацию о последовательностях молекул РНК всех трех классов: рибосомной РНК (рРНК), транспорт-ной РНК (тРНК) и информационной (или матричной) РНК (мРНК).

В эукариотических клетках имеются три различные РНК-по-лимеразы, каждая из которых специфически узнает промоторы, контролирующие транскрипцию трех различных классов молекул РНК. РНК-полимераза I локализуется в ядрышке и синтезирует основные рибосомные РНК. РНК-полимераза III осуществляет транскрипцию транспортных РНК и одного ком-понента рибосом - 5SPHK. Транскрипция молекул мРНК, не-сущих информацию о структуре белков, осуществляется РНК-полимеразой II. Ферменты II и III типа локализуются в нуклеоплазме.

Процессы образования мРНК в прокариотических и эукариотических клетках характеризуются существенными различиями. В эукариотических клетках после инициации транскрипции происходит модификация 5'-трифосфата в образующейся цепи за счет присоединения так называемого кэпа – метилированного остатка гуанозина. Кроме того, у большинства транскриптов происходит также модификация 3'-концов - по окончании транскрипции к ним присоединяется цепочка из остатков аденина, образующая характерный ро1уА-«хвост» (исключением из этого правила являются мРНК гистонных белков). У всех эукариот при транскрипции ДНК образуются молекулы РНК трех вышеназванных классов. Все они участвуют в процессе трансляции - третьей разновидности матричных процессов передачи информации - от РНК к белку.

49. Асимметричность транскрипции

Принципы транскрипции

1.Комплемептарность. 2.Антипараллельность.

3.Униполярность. 4.Беззатравочностъ. 5.Асимметричность.

Асимметричность.

В качестве матрицы используется одна цепь ДНК. Не совсем ясно, как ферментная система осуществляет правильный выбор нужной цепи. Видимо, ключевую роль играют какие-то последовательности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые системой.

50. РНК-полимеразы эукариотических организмов

Транскрипционный аппарат эукариотических клеток устроен значительно сложнее и изучен хуже, чем бактериальный. У эукариот обнаружены 3 ядерные РНК-полимеразы, отличающиеся разной локализацией в ядре и состоящие из большого числа субьединиц. Кроме того, в митохондриях и хлоропластах эукариотических клеток имеются свои собственные РНК-полимеразы.

Основная часть полимеразной активности приходится на долю РНК Pol І, которая обнаруживается в ядрышках и ответственна за транскрипцию генов рРНК. На долю этого фермента приходится 50-70% клеточного синтеза РНК и эта РНК-полимераза стимулируется в равной степени ионами Mn²⁺ и Mg²⁺

Другим важным ферментом является РНК Pol ІІ. Она локализована в нуклеоплазме (всё ядро за исключением ядрышка). Этот фермент синтезирует 20-40% всех молекул РНК в клетке и ответственен за синтез гетерогенныхядерных РНК (гяРНК), которые являются предшественниками иРНК. Эта РНК-полимераза намного сильнее стимулируется ионами Mn²⁺, чем ионами Mg²⁺.

РНК Pol ІІІ представляет собой минорную ферментативную активность, обеспечивающую 10% клеточного синтеза РНК, локализована в нуклеоплазме и осуществляет синтез малых ядерных РНК (мяРНК) и тРНК.

РНК-полимеразы эукариот имеют большую молекулярную массу и представляют собой комплекс мультимерных белков (500 –700 кД). От 14 до 17 субъединиц в зависимости от типа полимеразы.

НК-полимеразы различаются количеством субьединиц, их аминокислотным составом, и зависимостью от катионом магния и марганца. Для РНК-полимераз І и ІІІ необходимое для работы соотношение [Mn²⁺]/[Mg²⁺]=2. Для РНК-полимеразы ІІ - [Mn²⁺]/[Mg²⁺]=5.

Наиболее яркое различие – чувствительность к α-аманитину(токсину бледной поганки). Он полностью подавляет работу РНК-полимеразы ІІ в концентрации 10^-8 М и РНК-полимеразы ІІІ (в концентрации 10^-6 М). РНК-полимераза І фактически не чувствительна к этому токсину.

Помимо ядерных РНК-полимераз у эукариот есть ещё РНК-полимеразы хлоропластов и митохондрий. Они кодируются в ядре, а не в соответствующих органеллах.

В органеллах образуются свои tРНК и rРНК и рибосомные белки.

51. РНК-полимеразы прокариот

Прокариоты содержат одну РНК-полимеразу.

РНК- полимераза Е.Coli – белок, имеющий четвертичную структуру. В клетке присутствует около 7000 молекул РНК-полимеазы.

Субьединичный состав РНК-полимеразы Е.Coli:

2 αββ’ σ ω – holo-фермент (полный фермент).

2αββ’ω – core-фермент (150×115×110 А).

Без σ -фактора это core-фермент. σ -фактор – сменный фактор специфичности(σ ⁷⁰ , σ ²⁸ , σ ⁵⁴ и др.)

Две α-субьединицы – каркас РНК-полимеразы. К ним крепятся остальные субьединицы.

β’ - субьединица отвечает за прочное связывание с ДНК за счёт кластера положительно заряженных аминокислот.

β – в субьединице находятся два каталитических центра. Один отвечает за инициацию, а другой – за элонгацию РНК-цепи. Один центр работает в holo-, а другой в core-ферменте.

Для элонгации необходим комплекс α2ββ’, а для инициации к нему должна быть присоединена σ−субъединица. σ−субъединицы различаются в зависимости от того, какую группу промоторов должна узнавать РНК-полимераза. После инициации σ−субъединица диссоциирует и к элонгирующей РНК-полимеразе могут присоединяться ассоциированные факторы. Когда РНК-полимераза доходит до терминатора транскрипции, синтез РНК останавливается, РНК-полимераза и синтезированная РНК диссоциируют.

Кор-фермент α₂ββ’ω обладает полимеризующей активностью.

σ-фактор обеспечивает узнавание промотора и инициацию.

Полный фермент- холофермент (Mg²⁺) α₂ββ’ω σ.

52. Строение РНК-полимеразы прокариотических организмов

РНК-полимераза бактерий сосотоит из 5 субьединиц – (кор-фермент)

2αββ’ω+ σ-фактор (полный holo-фермент).

У прокариот имеется 2 типа РНК-полимеразы: одна из них синтезирует РНК-затравки для фрагментов Оказаки, а другая - все остальные типы РНК.

Синтез РНК (транскрипция) осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНК-полимеразами. РНК-полимеразы используют в качестве субстратов нуклеозидтрифосфаты и активны только в присутствии ионов Mg²⁺. РНК-полимеразы не нуждаются в праймере. Бактериальные РНК-полимеразы – сложные белки, состоящие из нескольких субъединиц. Наиболее изученный фермент кишечной палочки содержит 5 субъдиниц: две субъединицы α и по одной β, β´, ώ (основа фермента – кор). После присоединения к кору еще одной субъединицы – σ-фактора – образуется холофермент РНК-полимераза. Функцией холофермента РНК-полимеразы является связывание с промотором и инициация транскрипции. Кор-фермент (α,α,β,β´) осуществляет элонгацию, т.е. собственно синтез РНК.

53. Структура промоторов прокариотических организмов

Прокариотические промоторы варьируют в размерах–от 20 до 200п.н., но наиболее типичным является промотор, величиной 40п.н.

Промотор - это участок ДНК, ответственный за связывание с РНК-полимеразой. В случае прокариот, наиболее важными для регуляции транскрипции являются последовательности, обозначаемые «—35» и «— 10». Нуклеотиды, расположенные до инициирующего кодона («вверх по течению») записываются со знаком «-», а со знаком «+» - все нуклеотиды, начиная с первого в инициирующем кодоне (стартовая точка). Направление, в котором продвигается процесс транскрипции, называется «вниз по течению». Последовательность, обозначаемая «-35» (TTGACA), отвечает за узнавание промотора РНК-полимеразой, а последовательность «-10» (или бокс Прибнова) является тем участком, с которого начинается раскручивание двойной спирали ДНК. В состав этого бокса наиболее часто входят основания ТАТААТ. Такая последовательность оснований чаще всего встречается в промоторах прокариот, ее называют консенсусной. В состав ТАТА-бокса входят аденин и тимин, между которыми имеются только две водородные связи, что облегчает расплетание цепей ДНК в этом районе промотора. В случае замен пар оснований в указанных последовательностях промотора нарушается эффективность и правильное определение точки начала транскрипции, с которой фермент РНК-полимераза начинает синтез РНК. Когда благодаря действию специфических регуляторных элементов уровень экспрессии генов возрастает, регуляция называется позитивной. Позитивная регуляция может осуществляться путем связывания специфических белков с нуклеотидными последовательностями, расположенными в области промотора. Считается, что связанный активаторный белок способствует ассоциации РНК-полимеразы с промотором и, следовательно, увеличивает вероятность инициации транскрипции.

54. Строение мРНК эукариот

Эукариотические мРНК довольно стабильны. Период их полураспада измеряется часами и даже сутками. Эукариотические мРНК синтезируются в виде предшественников и проходят в своем биогенезе стадию довольно сложного созревания, или процессинга.

Каждая мРНК содержит информацию о составе той или иной полипептидной цепи, количество разных мРНК в клетке очень велико. линейная цепь мРНК содержит несколько областей с различной функциональной ролью:

а) На 5'-конце находится КЭП (участок из 1-4 модифицированных нуклеотидов). Такая стр-ра защищает 5‘-конец мРНК от экзонуклеаз.

б)У эукариот за «колпачком»(КЭП) идет 5'-нетранслируемый участок — последовательность из нескольких десятков нуклеотидов. Она комплементарна одному из отделов той рРНК, которая входит в малую субъединицу рибосомы. За счет этого она служит для первичного связывания мРНК с рибосомой,но сама не транслируется.

в) Трансляция мРНК начинается всегда с инициирующего кодона. Во всех мРНК он всегда один и тот же — АУГ,т. е. кодирует метионин. Поэтому после синтеза

пептидной цепи с ее N-конца,отщепляется метионин (если последний не нужен для функционирования белка).

г) За инициирующим кодоном в мРНК следует кодирующая часть, которая, содержит информацию о последоват-ти АК в белке.

У эукариот зрелые мРНК являются моноцистронными т. е. каждая из них несет информацию о структуре только одной полипептидной цепи. иногда пептидная цепь вскоре после образования на рибосоме разрезается на несколько более мелких цепей. У эукариот кодирующая часть зрелой мРНК лишена интронов — каких-либо вставочных некодирующих последовательностей.

д) По окончании кодирующего участка имеется кодон терминации — один из трех кодонов: УАА, УАГ или УГА.

е) За этим кодоном м.следовать еще 3'-нетранслируемый участок, значит.превышающий по длине 5'-нетранслируемую область.

ж)почти все зрелые мРНК эукар(кроме гистоновых мРНК)на З'-конце содержат поли(А)-фрагмент из 150-200 адениловых нуклеотидов.

И З'-нетранслируемый участок, и поли(А)-фрагмент имеют отношение к регуляции продолжительности жизни мРНК, поскольку разрушение мРНК осуществляется 3-экзонуклеазами.

В клетках молекулы мРНК практически всегда связаны с белками. Последние, стабилизируют линейную структуру мРНК, т. е. предупреждают образование в кодирующей части «шпилек». белки могут защищать мРНК от преждевременного разрушения. Такие комплексы мРНК с белками иногда называют информосомами.

55. Узнавание промотора в процессе транскрипции

Механизм транскрипции 4 этапа:

1.Узнавание промотора 2. Инициация

3.Элонгация 4.Терминация

Инициация транскрипции происходит на специфическом участке ДНК, называемом промотором. Для узнавания промотора необходим σ−фактор, причем различные σ−факторы отвечают за узнавание различных классов промоторов. Как правило узнаются блоки, отстоящие на 10 и 35 нуклеотидов от точки начала транскрипции. Затем присоединяется РНК-полимераза, представляющая собой тетрамер из субьединиц трёх видов: α, β, β’. В некоторых оперонах,например в лактозном, необходимо ещё предварительное взаимодействие с промотором дополнительного белка (CAP).

У эукариот всегда требуется предварительное связывание с промоторм целой совокупности белков – общих факторов транскрипции, с образование комплекса TFIID