4.3.9. Визначення алкалоїдів у зеленій масі люпину

З черешка свіжого листа, зірваного з верхньої частини рослини, вичавлюють краплю соку на лист білого паперу і одразу ж добавляють піпеткою розчин йоду в йодистому калії. Можна також зірваний молодий лист покласти на предметне скло і ручкою скальпеля чи скляною палочкою чавити черешок біля його основи. Потім додають 1-2 краплі йодистого реактиву 0,13% - ної концентрації. В обох випадках при наявності алкалоїдів спостерігається іржаво-коричневий колір. При відсутності алкалоїдів колір реактиву залишається незмінним. Таким же методом можна досліджувати насіння люпину. В цьому випадку реактив наносять на зріз насіння.

Йодистий реактив готується так: 2 г йодистого калію розчиняють в 3 мл води. В цей розчин додають 1,3 г кристалічного йоду. Рідину взбовтують до повного розчинення кристалів йоду. Отриманий маточний розчин доливають водою до 100 мл. Реактив слід зберігати в темному місці. Перед вживанням його розбавляють в 10 чи 20 разів.

Вище описаний метод можна також використовувати для орієнтовного кількісного визначення алкалоїдів в люпині. Якщо основний розчин реактиву, розчинений в 10 раз, не дає забарвлення, це означає що в люпині алкалоїдів не міститься. Основний розчин, розведений в 20 разів, при наявності алкалоїдів в кількості 0,1% і більше зразу ж дає характерний осад червоно-бурого кольору, якщо алкалоїдів менше 0,1%, такого осаду не спостерігається.

Ф.І. Овчередько (1971) розробив метод визначення алкалоїдів у люпині з допомогою алколоїдочутливого папірця. Техніка визначення зводиться до наступного. Зріз верхівки рослини вкладають в реактивний папір і міцно стискають пасатижами. При наявності алкалоїдів в люпині сік, який виступив, зафарбовує папір в оранжево-червоний колір, а при наявності хлорофілу забарвлення папірця від алкалоїдів получається у вигляді кайми навколо зелених плям (від хлорофілу) чи у вигляді оранжево-червоних плям між зеленими.

Реактивний папірець для визначення алкалоїдів у люпині готують таким чином. Фільтрувальний папір (ватман №1) розміром 10 см х70 см опускають в реактив, який складається з такої суміші: 20 мл розчину (0,42 г основного нітрату вісмуту, розчиненого в 25 мл 20%-ної оцтової кислоти) і 60 мл розчину (8 г йодистого калію, розчиненого в 20 мл дистильованої води). Папірець висушують в вертикальному положені при кімнатній температурі до повітряно-сухого стану і розрізують на смужки розміром 2,5 см х 8см (Новиков Г.К., Баньковський А.І., 1959)

При необхідності отримати дані про точний вміст алкалоїдів у кормі його направляють для дослідження в лабораторію. Маючи відповідні дані про вміст алкалоїдів у кормі, розраховують допустиму норму згодовування корму тваринам з урахуванням встановленої норми токсичності алкалоїдів і живої маси тварин.

4.3.10. Визначення алкалоїдів у насінні люпину (за Махом і Ледерлеєм)

Принцип методу

Метод ґрунтується на здатності алкалоїдів кількісно осаджуватись розчином кременевольфрамової кислоти з утворюванням комплексних солей. При прокалюванні осаду алкалоїд згоряє, а в тиглі залишається кременевольфрамова кислота. За різницею між масами тигля з осадом до і після зпалювання визначають масу чистого алкалоїду.

Хід аналізу

В колбу на 500 мл з притертою пробкою відважують 10 г повітряно-сухого дрібнопомеленого борошна з насіння люпину, вливають 100 мл 15 %- ного сірчаного ефіру, 50 мл хлороформу чи діхлоретану і 10 мл 15 %-ного розчину їдкого натрію чи 20 % - ного розчину аміаку, збовтують протягом 30 хвилин і залишають на ніч для видалення алкалоїдів. Якщо вранці рідина, яка залишилась, недостатньо прозора, то додають декілька крапель води і колбу з вмістимим взбовтують, після чого настає швидке освітління розчину. Потім рідину фільтрують через лійку Брюхера, осад на фільтраті промивають сірчаним ефіром, а фільтрат, який містить алкалоїди, переносять в циліндричну мірну воронку, доливають 25 мл 1 % - ного розчину соляної кислоти, збовтують і як можна повніше зливають в розчин кислоти. Цю операцію повторюють 3-4 рази до повного видалення алкалоїдів у вигляді солянокислої солі. Для перевірки повноти видалення беруть з мірної лійки небагато хлороформної рідини в фарфорову чашку, випарюють на водяній бані, залишок розчиняють у воді і досліджують кременевольфрамовою кислотою.

Солянокислу витяжку, яка містить солі алкалоїдів, переносять у фарфорову чашку і нагрівають у водяній бані до повного видалення слідів ефіру. Після охолодження розчину зливають в конічну колбу на 250 мл і осаджують алкалоїди 20 %-ним розчином кременевольфрамової кислоти, доливаючи її по краплях до припинення утворювання муті від додавання однієї краплі солі.

Осад змучують, розчин залишають на ніч, а потім відфільтровують через підготовлений тигель Гуча з азбестом. Осад кременевольфрамової кислоти з алкалоїдами промивають на тиглі невеликою кількістю 1 % - ного розчину соляної кислоти і сушать при 100°С до постіної ваги. Потім тигель ставлять у муфель, алкалоїди згоряють і залишається тільки кременевольф­рамова кислота (Si₂12WO₃).

Різниця між масою осаду в тиглі до і після прокалювання відповідає сухій речовині алкалоїду. Знайдену кількість алкалоїдів перераховують на масу наважки і виражають в процентах, якщо хімічний склад алкалоїду невідомий. Якщо ж формула алколоїда відома, то ваговий вміст його вираховують за масою прокаленого осаду (Si₂12WO₃), помноживши його на відповідний даному алкалоїду коефіцієнт.

Наприклад, для алкалоїду, який міститься в синьому люпині (люпанін), цей коефіцієнт (Х) вираховують на основі відношення:

Х= М₀/М₁=496/2844,2=0,1743,

де: М₀- маса двох молекул алкалоїду люпаніну С₁₅Н₂₄N₂O;

М₁ - молекулярна маса кременефольфрамової кислоти (2844,2).

Якісне визначення. В водну витяжку з 10 г досліджуємого корму, подрібненого до проходу через сито з отворами діаметром 1 мм (на 10 г берут 50 мл дистильованої води, настоюють 3 години і потім фільтрують), додають 5 мл розчину їдкого натрію, 1 мл розчину сірчанокислого заліза і кип’ятять 30 хвилин. Після цього розчин підкисляють соляною кислотою до отримання кислої реакції, яку визначають лакмусом, і додають декілька крапель розчину хлорного заліза. При наявностіі синильної кислоти розчин забарвлюється в синій колір.

Кількісне визначення можна проводити так. 100 г досліджуємого корму, подрібненого до проходу через сито з отвірами діаметром 1 мм, зважують з точністю до 0,1 г, переносять в плоскодонну колбу і додають в неї 500 мл дистильованої води, яка нагріта до 45-50С.

Колбу з розчином щільно закривають пробкою, ретельно перемішують його і витримують на водяній бані при 45-50С протягом 2,5-3 годин, після чого підкислюють 50 мл розчину винної кислоти. Колбу ставлять у водяну баню, яка кипить і з'єднують з пароутворювачем і холодильником. До холодильника приєднують конічну колбу ємкістю 750 мл з 25-30 мл розчину їдкого натрію. Під час відгонки трубка, яка підводить пару в колбу, і кінець форштоса холодильника повинні бути занурені в рідину. Після отримання 400-500 мл дистиляту відгонку припиняють. Дистилят титрують 0,1 н. розчином азотнокислого срібла, додаючи його поступово, краплями до моменту появи незникаючого при збовтуванні білого осаду.

Вміст синильної кислоти (Х) у відсотках обчислюють за формулою:

Х=ТV0,318100/m

де: Т – титр 0,1 розчину азотнокислого срібла, який виражен в мг;

V – кількість 0,1 н. розчину азотнокислого срібла, який використаний на титрування дистиляту, мл;

0,318 – коєфіцієнт перерахунку кількості азотнокислого срібла на синильну кислоту;

m – наважка корму, г.

За кінцевий результат приймають середнє арифметичне двох паралельних визначень. Допустимі розходження при паралельних визначеннях не повинні перевищувати  0,005%.