6.2. Ростовые и селективные свойства питательных сред

Основными биологическими критериями качества питательных сред являются их ростовые и селективные свойства, определяемые с помощью микроорганизмов и стандартных питательных сред. В качестве стандартных используют среды, готовые к употреблению, с сертификатом производителя, а также аттестованные в лаборатории среды высокого качества.

Ростовые свойства – это способность питательной среды обеспечивать эффективный и типичный рост соответствующих микроорганизмов.

Селективные свойства – это способность питательной среды частично или полностью подавлять рост сопутствующих микроорганизмов (ассоциантов) при обеспечении роста тест-штаммов.

Тест-микроорганизмы, штаммы-ассоцианты и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред представлены в табл. 32.7.

Приготовление рабочей взвеси микроорганизмов

Культуры бактерий и C.albicans смывают с поверхности скошенного агара стерильным 0,9 % раствором натрия хлорида. Готовят стандартные взвеси каждого тест-штамма, соответствующие 10 Единицам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85. Для культур Bacillus subtilis, Bаcillus cereus и Candida albicans – это концентрация 10⁷ КОЕ/мл, для Escherichia coli, Salmonella abony, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus – 10⁹ КОЕ/мл. Стандартные взвеси методом последующих десятикратных разведений доводят стерильным

0,9 % раствором натрия хлорида до концентрации 10² и 10³ КОЕ/мл. Для определения фактической концентрации рабочих взвесей бактерий и C.albicans, высевают поверхностным методом из концентрации 10³ КОЕ/мл по 0,1 мл на чашку с соответствующей агаризованной средой.

Для смыва конидий A.niger с агара Сабуро используют стерильный 0,9 % раствор натрия хлорида, содержащий 0,05 % твина-80 (П48). Количество конидий в 1мл взвеси определяют с помощью камеры Горяева или посевом подходящего разведения на агар Сабуро.

Для посева готовят рабочую взвесь A.niger с концентрацией конидий 0,5·10³ в 1 мл, которую высевают поверхностным методом по 0,1 мл на чашки с агаром Сабуро.

Приготовленные рабочие взвеси монокультур используют для определения ростовых и селективных свойств питательных сред. Для определения селективных свойств дополнительно готовят посевную дозу, состоящую из равных количеств рабочих взвесей тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта, при этом количество КОЕ штамма-ассоцианта должно быть на 2 порядка выше.

^{Определение ростовых свойств агаризованных сред}

Испытуемую и стандартную агаризованные среды разливают в чашки Петри диаметром 90 мм по 15 мл, подсушивая агар после застывания. По 0,1 мл рабочей взвеси тест-микроорганизма с концентрацией 10³ КОЕ/мл засевают поверхностным методом на чашки с испытуемой и стандартной средами в тройной повторности.

На агаризованных средах после инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по формуле:

N

К = — ,

^N_о

^{где: N – среднее арифметическое число колоний на чашке с испытуемой}

средой;

N_о – среднее арифметическое число колоний на чашке со стандартной средой.

Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой.

Определение ростовых свойств жидких сред

Жидкие испытуемые и стандартные питательные среды разливают в стерильные пробирки размером 15×150 мм по 10 мл. По 1,0 мл рабочей взвеси тест-микроорганизма с концентрацией 10² КОЕ/мл засевают в 3 пробирки с каждой средой. Рост микроорганизмов определяют визуально по помутнению и/или изменению цвета среды после периода инкубации. Из пробирок, в которых наблюдается рост, после предварительного разведения до 10³ КОЕ/мл делают пересев по 0,1 мл на соответствующую стандартную агаризованную среду. После инкубации описывают морфологические особенности колоний, подсчитывают колонии тест-микроорганизмов и определяют коэффициент прорастания по указанной выше формуле.

Испытуемая жидкая среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой.

Определение селективных свойств

Для оценки селективных свойств питательных сред испытуемую и стандартную среды заражают взвесью тест-микроорганизмов (монокультура) и параллельно смесью тест-штамма и штамма-ассоцианта в определенной пропорции. В случае нескольких штаммов-ассоциантов каждый из них смешивают с тестмикроорганизмом отдельно.

Посев на агаризованные среды осуществляют поверхностным методом. В 3 чашки с каждой средой (испытуемой и стандартной) вносят по 0,1 мл рабочей взвеси монокультуры, содержащей около 10³ КОЕ/мл. Параллельно в 3 чашки с каждой средой вносят по 0,1 мл посевной дозы, содержащей взвеси тестмикроорганизма и штамма-ассоцианта. На всех засеянных чашках после оптимального срока инкубации при соответствующей температуре отмечают рост

^{характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста}

штамма-ассоцианта.

Для посева на жидкие питательные среды (стандартную и испытуемую) аналогично используют монокультуру тест-микроорганизма и посевную дозу тест-микроорганизма со штаммом-ассоциантом. В 3 пробирки каждой среды вносят по 1 мл рабочей взвеси монокультуры тест-микроорганизма. Параллельно в 3 пробирки вносят по 1 мл посевной дозы тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта.

Для качественной оценки селективных свойств среды через 24 ч инкубации делают пересев из каждой пробирки, в которой наблюдают рост, бактериологической петлей на чашки с соответствующей агаризованной средой. После инкубации на чашках должен наблюдаться рост характерных колоний тест-микроорганизма при отсутствии или угнетении роста штамма-ассоцианта.

Для характеристики питательных сред учитывают коэффициент прорастания и селективные свойства, а также морфологию выросших колоний.

Таблица 32.7

Тест-микроорганизмы и условия инкубации для определения ростовых и селективных свойств питательных сред

Питательные среды	Назначение	Тест-микроорганизмы	Время и температура инкубации
1	2	3	4
● Соево-казеиновый агар ● Среда № 1 для выращива- ния бактерий	Аэробные бактерии	Bacillus subtilis ATCC 6633 или Bacillus cereus ATCC 10702; Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538-P	72 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Сабуро агар с глюкозой и антибиотиками ● Среда № 2 для выращива- ния грибов	Дрожжи, плесени	Candida albicahs NCTC 885-653 или Candida albicans АТСС 10231; Aspergillus niger АТСС 9642 Штаммы-ассоцианты: Staphylococcus аureus ATCC 6538-P Bacillus cereus ATCC 10702	5 сут (22,5 ± 2,5) ºС
● Бульон Мосселя ● Мак-Конки бульон ● Среда № 3 для обогаще- ния энтеробактерий	Обогащение энтеробактерий	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39 Штаммы-ассоцианты: Staphylococcus аureus ATCC 6538-P Bacillus cereus ATCC 10702	24-48 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Мак-Конки агар ● Мосселя агар ● Среда № 4 для выделения энтеробактерий	Энтеробактерии	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39 Штаммы-ассоцианты: Staphylococcus аureus ATCC 6538-P Bacillus cereus ATCC 10702	24-48 ч (32,5 ± 2,5) ºС

Продолжение таблицы 32.7

1	2	3	4
● Дезоксихолат-цитратный агар ● Ксилоза-лизин-дезоксихолат агар ● Агар с бриллиантовым зеленым ● Висмут-сульфитный агар ● Среда № 5 для идентификации саль- монелл	Сальмонеллы	Salmonella abony IHE 103/39 Штаммы-ассоцианты: Escherichia coli ATCC 25922 Staphylococcus аureus ATCC 6538-P Bacillus cereus ATCC 10702	24-48 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Бульон с глюкозой ● Среда № 6 для идентификации эн- теробактерий	Энтеробактерии	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa ГИСК 453)	24 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Нитратный бульон ● Среда № 7 для идентификации энте- робактерий	Энтеробактерии	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa ГИСК 453)	24 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Cоево-казеиновый бульон ● Среда № 8 для выращивания бакте- рий	Аэробные бактерии	Bacillus cereus ATCC 10702 или Bacillus subtilis ATCC 6633; Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538-P; Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa ГИСК 453)	24 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Лактозный бульон ● Среда № 11 для предварительной ин- кубации энтеробактерий	Энтеробактерии	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39	24 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Агар для выявления пиоцианина P.aeruginosa ● Среда № 9 для идентификации P.aeruginosa	Синегнойная палочка	Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa ГИСК 453); Escherichia coli ATCC 25922	24-48 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Цетримидный агар ● ЦПХ-агар для выделения P.aeruginosa	Синегнойная палочка	Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa ГИСК 453) Штаммы-ассоцианты: Escherichia coli ATCC 25922; Staphylococcus аureus ATCC 6538-P	24-48 ч (32,5 ± 2,5) ºС

Окончание таблицы 32.7

1	2	3	4
● Фогель-Джонсона агар ● Среда № 10 для выделения S. aureus ● Берда-Паркера агар	Золотистый стафилококк	Staphylococcus аureus ATCC 6538-P; Staphylococcus еpidermidis АТСС 14990 Штаммы-ассоцианты: Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 (P. aeruginosa ГИСК 453); Escherichia coli ATCC 25922	48 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Селенитовый бульон ● Тетратионатный бульон ● Среда № 12 для выделения сальмонелл	Сальмонеллы	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39	18-24 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Трехсахарный агар с солями железа ● Среда № 13 для идентификации сальмонелл	Сальмонеллы	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39	24 ч (32,5 ± 2,5) ºС
● Цитратный агар Симмонса ● Среда № 14 для идентификации E.coli	Кишечная палочка	Escherichia coli ATCC 25922; Salmonella abony IHE 103/39	24 ч (32,5 ± 2,5) ºС

^*АТСС – Американская коллекция типовых культур (American Type Culture Collection), Соединенные Штаты Америки.

ГИСК - Всероссийский музей патогенных бактерий ГИСК им. Л.А. Тарасевича, Россия.

IHE – Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, Чехия. ССМ – Чешская коллекция микроорганизмов.

^{Требование к ростовым свойствам питательных сред}

Испытуемая агаризованная среда считается годной к употреблению, если коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной питательной средой. Испытуемая жидкая (полужидкая) среда считается годной к употреблению, если после инкубации рабочей взвеси и пересеве подходящего разведения на агаризованную среду коэффициент прорастания не менее 0,7 по сравнению со стандартной жидкой питательной средой.

Требование к селективным свойствам питательных сред

Испытуемая селективная питательная среда при посеве тест-микроорганизма и штамма-ассоцианта должна обеспечивать доминирующий рост тест-микроорганизма при частичном или полном угнетении роста штамма-ассоцианта.

Стерильность

Не менее 10 % емкостей (флаконов, пробирок) от каждой партии приготовленной питательной среды контролируют на стерильность, выдерживая их при соответствующей температуре в течение 48-72 ч. При обнаружении микробного роста хотя бы в одной из емкостей, испытанию на стерильность подлежит вся приготовленная партия среды.

Хранение питательных сред

Сухие питательные среды необходимо хранить в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-30 ºС герметично закрытыми. После вскрытия упаковки на флаконе необходимо написать дату и далее хранить при комнатной температуре до окончания срока годности.

Приготовленные из сухих смесей и разлитые во флаконы питательные среды хранятся 1 месяц при комнатной температуре или 3 месяца при (5 ± 1) ºС.

Срок годности сред, разлитых в чашки, составляет 7 дней при температуре

(5 ± 1) ºС.

Исключение составляют чашки со средой № 4, срок годности которых не более 3 сут. без доступа света.

АНТИБИОТИКОВ МЕТОДОМ ДИФФУЗИИ В АГАР (ОФС 42-0068-07)

Определение антимикробной активности антибиотиков основано на их способности угнетать рост микроорганизмов. Определение проводят методом диффузии в агар на плотной питательной среде путем сравнения размеров зон угнетения роста тест-микробов, образующихся при испытании растворов определенных концентраций Государственного стандартного образца * и испытуемого препарата.

Антимикробная активность антибиотиков выражается в единицах действия – ЕД или «мкг». Для большинства антибиотиков 1 ЕД или «мкг» соответствуют 1 мкг активного вещества (кислоты или основания); для ^{антибиотиков, имеющих иное количественное выражение единицы, соответ-}

^{ствующие указания даются в частных фармакопейных статьях.}

^{При определении антимикробной активности антибиотиков используют стандартные образцы, активность которых, как правило, устанавливают в соответствии с Международными биологическими стандартами. При отсутствии последних для указанных целей могут быть использованы международные химические стандарты, антимикробную активность которых рассчитывают на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами. Антимикробную активность стандартных образцов антибиотиков, не имеющих аналогов в международной коллекции стандартов, рассчитывают также на основании показателей качества, установленных физико-химическими методами.}

^{Стандартные образцы антибиотиков хранятся и используются в соответствии с рекомендациями, указанными на этикетке стандартного образца.}

^{Метод определения. Тест-микробы, растворители, буферные растворы, питательные среды и прочие условия проведения испытания указаны в табл. 33.1.}

^{В чашки Петри (стеклянные или пластмассовые), установленные на столиках со строго горизонтальной поверхностью, разливают расплавленные питательные среды определенного состава в один или два слоя. Для нижнего слоя используют незасеянные среды, для верхнего или одного слоя – агаровую среду, предварительно засеянную соответствующим тест-микробом. Если культура представляет собой суспензию вегетативных клеток, то температура расплавленной среды, в которую вносят тест-микроб, должна быть (49 ± 1) °С, при использовании суспензии спор – 65-70 °С. К среде следует добавить такое количество суспензии вегетативных клеток или спор, которое обеспечивает оптимальный рост тест-микроба и четкость зон угнетения его роста.}

* Далее «стандартный образец» следует читать «Государственный стандартный образец».

^{Шесть стерильных цилиндров единого размера и массы, высотой (10,0 ± 0,1) мм и внутренним диаметром (6,0 ± 0,1) мм, из нержавеющей стали или алюминия расставляют на поверхности засеянной среды на равном расстоянии друг от друга и от края чашки. Вместо цилиндров могут быть использованы лунки диаметром от 6 до 8 мм, сделанные в толще агара с помощью стерильного сверла, либо другого соответствующего приспособления.}

^{В цилиндры или лунки каждой чашки вносят равные объемы рабочих растворов стандартного и испытуемого образцов. Основные растворы стандартных и испытуемых образцов готовят в стерильных растворителях с концентрацией 1 мг/мл. Затем из основных растворов в зависимости от применяемого варианта метода диффузии в агар (трехдозного или с построением стандартной кривой) готовят рабочие растворы трех или одной концентраций испытуемого образца и растворы трех или пяти концентраций стандартного образца.}

^{Рабочие растворы испытуемых образцов готовят из основных растворов таким образом, чтобы их концентрации не имели существенных отличий от концентраций раствора стандартного образца.}

^{Для уменьшения влияния колебаний во времени между закапыванием растворов, используемых в опыте, рекомендуется после их внесения выдерживать}

Таблица 33.1