5. Биохимические тесты для идентификации микроорганизмов

5.1. Тест на наличие цитохромоксидазы

Реактив: 1% раствор N,N-диметил-пара-фенилендиамина дигидрохлорида. Раствор хранят при температуре от 4 до 10 ºС во флаконах нейтрального све-

тозащитного стекла. Раствор должен быть бесцветным.

Полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом. Платиновой петлей или стеклянной палочкой наносят 24-часовую чистую культуру исследуемых бактерий, выросших на соево-казеиновом агаре или среде № 1. Темно-красное окрашивание, появляющееся в течение 1 мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции. Положительным контролем служит культура P.aeruginosa, отрицательным – культура E.coli.

5.2. Тест на наличие индола

Реактив Ковача:

Спирта амилового (П9) или изоамилового (И5) – 75 мл Пара-диметиламинобензальдегида (Д38) – 5 г Хлористоводородной кислоты конц. (Х21) – 20 мл

^{Навеску альдегида растворяют в спирте при легком нагревании (на водяной}

бане при 50-55 ºС), остужают и медленно добавляют кислоту. Раствор хранят в защищенном от света месте при температуре от 4 до 10 ºС. Реактив должен быть желтого цвета. При неправильном хранении цвет реактива становится коричневым, и реактив непригоден для использования.

В пробирку с соево-казеиновым бульоном или со средой № 15, в которой выросла исследуемая культура, вносят 0,5 мл реактива Ковача и слегка встряхивают. Через несколько минут при наличии индола наблюдают появление ^{красного кольца на поверхности среды в пробирке. Положительным контролем} является культура E.coli, отрицательным – культура S.abony.

5.3. Тест на наличие коагулазы (реакция плазмокоагуляции)

Сухую цитратную кроличью плазму разводят согласно приложенной инструкции 0,9 % стерильным раствором натрия хлорида изотоническим и разливают по 0,5 мл в стерильные пробирки. В пробирку помещают 1 петлю суточной культуры выделенных кокков, выращенных на соево-казеиновом агаре или на среде № 1. Положительным контролем служит культура S.aureus, отрицательным – культура S.epidermidis. Необходимо поставить также контроль неконтаминированной плазмы. Пробирки инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС. Реакцию плазмокоагуляции отмечают через каждый час в течение 4-6 ч, слегка наклоняя пробирку, но, не встряхивая ее.

При отсутствии положительной реакции плазмокоагуляции удлиняют время инкубации до 24 ч для получения окончательных результатов.

Тест на наличие коагулазы считается положительным при коагуляции плазмы.

6. Питательные среды. Определение ростовых и селективных свойств

Для испытания лекарственных средств на стерильность и микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства.

Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры, а сухие питательные среды – согласно инструкции по применению предприятия-изготовителя. Необходимый рН питательных сред устанавливают при температуре (25 ± 2) ºС. Среды стерилизуют в автоклаве в течение 15 мин при температуре 121 ºС, если нет других указаний, при условии валидации процесса стерилизации.

Определение ростовых и селективных свойств проводят для каждой серии коммерческой среды (сухой и готовой к использованию), а также для каждой партии среды, изготовленной в лаборатории.

Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие микроорганизмов- контаминантов лекарственных средств.