2.6. Лекарственные растительные средства

Особенности пробоподготовки цельного, измельченного сырья, фильтр-пакетов, брикетов представлены в ОФС «Методы микробиологического контроля лекарственных растительных средств, состоящих из одного вида сырья или нескольких (сборов) – фасованная продукция, а также растительного сырья «ангро».

3. Методы количественного определения аэробных бактерий и грибов

Представленные методы предназначены для количественного определения мезофильных бактерий и грибов, которые растут в аэробных условиях.

3.2. Количественное определение микроорганизмов

В зависимости от природы лекарственного средства и его физико-химических свойств используют один из вариантов чашечного агарового метода (глубинный, двухслойный, поверхностный, модифицированный глубинный), метод мембранной фильтрации или пробирочный метод наиболее вероятных чисел (НВЧ).

3.2.1. Чашечный агаровый метод

Для культивирования микроорганизмов используют агаризованные питательные среды: соево-казеиновый агар или среду № 1, сухую, для контроля микробной загрязненности – для выращивания бактерий, агар Сабуро или среду

№ 2, сухую, для контроля микробной загрязненности – для выращивания грибов.

Если нет других указаний в частной фармакопейной статье, посевы на среде для выращивания бактерий инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС, а на среде для грибов – при температуре (22,5 ± 2,5) ºС.

Для каждого разведения образца используют не менее 2-х чашек Петри с определенной средой.

После расплавления среды охлаждают до температуры (45 ± 5) ºС и вносят в чашки Петри в необходимом количестве.

Глубинный метод

Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 15-20 мл агаризованной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют посевы.

Двухслойный метод

Агаризованные питательные среды вносят в количестве 15-20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают.

Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в пробирку с 4 мл соответствующей расплавленной и охлажденной питательной среды, быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят на поверхность застывшего и подсушенного агара в чашке Петри, равномерно распределяя верхний слой среды вращательными движениями. После застывания чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации.

Поверхностный метод

Расплавленные и охлажденные питательные среды вносят в количестве 15-20 мл в каждую стерильную чашку Петри диаметром 90 мм и оставляют до застывания. При большем диаметре чашек Петри количество среды соответственно увеличивают. Поверхность агара в чашках подсушивают.

Образец, приготовленный для анализа, наносят на агар в количестве 0,1 мл и равномерно распределяют шпателем по поверхности среды.

Чашки переворачивают и помещают в термостат для инкубации.

^{Модифицированный глубинный метод}

Образец, приготовленный для анализа, в количестве 1 мл вносят в стерильную чашку Петри диаметром 90 мм. Добавляют 7-10 мл расплавленной и охлажденной питательной среды и быстро перемешивают вращательными движениями. После застывания агара чашки переворачивают и инкубируют. Учет результатов производят через 48-72 ч.

Учет результатов посевов чашечными методами

Посевы просматривают ежедневно. Подсчет колоний производят через 48-72 ч (предварительный результат) и через 5 сут (окончательный результат).

Для получения достоверных результатов отбирают чашки, где число колоний бактерий находится в пределах от 30 до 300, а колоний грибов – от 10 до 100. Если при учете результатов двух последующих разведений число колоний на чашках находится в указанных выше пределах, рассчитывают результаты из меньшего разведения.

Если в среднем на чашках выросло более 300 колоний бактерий или более 100 колоний грибов, делают ряд дальнейших последовательных разведений образца, выбирая подходящее для посева.

Если в среднем на чашках выросло менее 30 колоний бактерий и менее 10 колоний грибов, делают расчет количественного содержания бактерий и грибов по имеющимся результатам.

Если на питательной среде отсутствует рост микроорганизмов, результаты отмечают следующим образом: при посеве лекарственного средства в разведении 1:10 – «В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 10 бактерий (или грибов)», при посеве лекарственного средства в разведении 1:100 – «В 1 г (или в 1 мл) лекарственного средства содержится менее 100 бактерий (или грибов)» и т.д.

Количество микроорганизмов в 1 г или в 1 мл рассчитывают по формуле:

c

N = ––– × d ,

n

где: N – количество микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл; с – сумма колоний на всех чашках; n – число чашек; d – коэффициент разведения образца.

При подсчете количества микроорганизмов в 1,0 г или в 1,0 мл образца, полученный результат выражают в виде числа в пределах от 1,0 до 9,9, умноженного на 10^х, где х – соответствующий показатель степени основания 10.

Пример. При посеве из разведения 10^-2 на двух чашках выросло 168 и 215 колоний:

168 + 215

N = –––––––––– × 10² = 19 150 .

2

Полученный результат округляют до двух значащих цифр – 19 000 и записывают как 1,9 × 10⁴.

^{Интерпретация результатов}

При необходимости подсчета общего количества микроорганизмов (бактерий и грибов суммарно) в 1 г или в 1 мл лекарственного средства следует сложить число аэробных бактерий с числом грибов.