1.3. Проведение испытания

Испытание на наличие антимикробного действия проводят одним из описанных ниже методов.

1.3.1. Разведение лекарственного средства

Готовят необходимые разведения лекарственного средства 1:10, 1:50, 1:100,

1:500 и 1:1000 методом последовательных разведений, используя фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном рН 7,0 (п. 4.2).

1.3.2. Приготовление инокулята

24-часовые бульонные культуры бактерий на соево-казеиновом бульоне или среде № 8 и 48-часовую культуру C.albicans на бульонной среде Сабуро разводят стерильным раствором натрия хлорида 0,9 % изотоническим 1:1000 (B.cereus, C.albicans) и 1:100000 (E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.aureus) до концентрации около 10⁴ КОЕ/мл. Взвесь спор B.subtilis также разводят до концентрации 10⁴ в 1 мл. Культуру A.niger смывают со скошенного агара Сабуро или со среды № 2 фосфатным буферным раствором с 0,05 % твина-80. Определяют количество конидий в 1 мл смыва, используя камеру Горяева или чашечный агаровый метод, и разводят до концентрации 10⁴ КОЕ/мл.

1.3.3. Метод определения антимикробного действия в условиях испытания на микробиологическую чистоту

Каждое разведение препарата в количестве 1 мл вносят в 6 чашек Петри диаметром 90 мм, в две из которых добавляют по 0,2 мл взвеси спор B.subtilis, в две другие – по 0,2 мл взвеси культуры C.albicans, в 2 последние – 0,2 мл взвеси конидий A.niger. Чашки с бактериями заливают 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (47,5 ± 2,5) ºС питательного агара, чашки с культурами грибов – тем же количеством среды Сабуро. По 1,0 мл каждого разведения препарата вносят в пробирки с 10 мл жидких сред № 3 и № 8 (или аналогичных), куда затем добавляют по 1 мл взвеси E.coli, S.аbony, P.aeruginosa, S.aureus соответственно средам, каждый микроорганизм отдельно. В контрольные чашки и пробирки вместо разведений препарата вносят такое же количество растворителя. Опыт ставят в двойной повторности. Посевы на средах № 1, 3, 8 инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС в течение 48 ч (среды № 3, 8) и 5 сут (среда № 1). Посевы на среде № 2 инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение 5 сут.

После окончания сроков инкубации отмечают появление типичного роста тест-микроорганизмов в контрольных чашках и пробирках без препарата и наличие или отсутствие роста тест-штаммов на средах с различными разведениями ^{препарата. В случае помутнения или изменения окраски среды, затрудняющих} учет результатов, делают пересевы на агаризованные среды. При росте типичных колоний E.coli, S.abony, P.aeruginosa, S.аureus отмечают отсутствие антимикробного действия исследуемого препарата.

1.3.4. Метод репликаций

Для водонерастворимых (суспензии, эмульсии и др.) или окрашенных соединений предпочтительно использовать метод репликаций.

В стерильные чашки Петри вносят по 1 мл каждого разведения исследуемого препарата. В контрольные чашки вносят по 1 мл разбавителя, используемого для получения разведений. В чашки Петри как в эксперименте, так и в контроле, добавляют по 10-15 мл расплавленного и охлажденного до (45 ± 2) ºС соево-казеинового агара или среды № 1, в другие – такое же количество среды Сабуро и тщательно перемешивают. Опыт ставят в двойной повторности.

После застывания агара чашки подсушивают для удаления конденсата с поверхности среды, на которую затем бактериологической петлей, пипеткой или репликатором наносят инокулят (п. 1.3.2) каждого тест-штамма бактерий и грибов в виде бляшек на среды № 1 и № 2 (или аналогичные) соответственно. Чашки с соево-казиновым агаром или средой № 1 инкубируют при температуре (32,5 ± 2,5) ºС в течение 48 ч. Чашки со средой Сабуро инкубируют при температуре (22,5 ± 2,5) ºС в течение не более 5 сут.