2.2.3 Полимеразная цепная реакция (пцр)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая синтетеческими олигонуклеотидными праймерами. ПЦР состоит из тепловой денатурации геномной ДНК, ее отжига с праймерами и удлинения цепи (элонгации); смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси. В ходе ПЦР происходит экспоненциальное увеличение количества копий амплифицируемой последовательности. Благодаря этому последовательности, присутствующие в клиническом препарате в минимальном количестве (одна или несколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляются с помощью ПЦР. Экспоненциальное увеличение числа копий молекулы-мишени не только связано с высокой чувствительностью метода, но и облегчает их выявление, а дизайн праймеров, комплементарных только амплифицируемому участку генома, обеспечивает специфичность реакции. Каждый раунд ПЦР занимает от 2 до 5 минут, и обычно для достижения необходимой чувствительности достаточно 25-35 раундов, т.е. 1,5-2 часа. Таким образом, весь анализ можно провести в течение одного дня.
Денатурация - в эту стадию происходит разлделение матричной ДНК на отдельные цепи. Температура денатурации устанавливается в пределах 94°-96° С и зависит от содержания GC связей (наиболее прочных);
Связывание (отжиг) праймеров – в эту стадию происходит спецефическое связывание (отжиг) праймера с комплементарной ему частью матричной ДНК. Температура отжига определяется по специальной формуле T(отжига)=2∙(t+a)+4∙(g+c), где t,a,g,c – количество соответствующих нуклеотидов в праймере. Эта формула имеет ограничения – может использоваться только при длинах праймеров до 15 п.н. При большей длине праймеров пользуются более точной формулой, представленной ниже :
T(отж)= 64,9°С +41°С(g+c - 16,4)\N , где N – длина праймера(п.н.) ;
Элонгация (удлинение) праймеров при синтезе ДНК – в эту стадию происходит удлинение праймеров на матричной последовательности в соответствии с принципом комплементарности исходной и синтезируемой цепей с участием фермента термостабильной Taq-полимеразы. Оптимальная температура - 72° С. Время этого этапа обычно определяется по длине ДНК, которое необходимо получить. Было определено, что полимераза при 72° С может удлинить фрагмент длиной в 1 т.п.н. за одну минуту. Итого, для фрагментов длиной 100-500 п.н. обычно ставится время элонгации в 30 секунд.
Основные этапы ПЦР изображены на рис. 1.
Рис.1. Принцип полимеразной цепной реакции. Двухцепочечную ДНК-матрицу денатурируют (разделяют на отдельные цепи) и проводят отжиг с двумя праймерами. Праймеры присоединяются к противоположным цепям навстречу друг другу, определяя границы целевого амплифицируемого фрагмента. В процессе достройки праймеров происходит копирование участка ДНК, расположенного между двумя праймерами, и в результате количество матрицы удваивается. Цикл реакций денатурации матрицы, отжига и удлинения праймеров повторяется 25-35 раз. При избытке праймеров и других компонентов реакции после 25 циклов теоретически может получиться более 8 млн копий фрагмента
В ходе анализа к 1,0 мкл геномной ДНК добавляли 0,3 мкл каждого праймера, 1,5 мкл эквимолярной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), 1ед Taq-полимеразы, 5 мкл 5-ти кратного (или 2,5 мкл 10-ти кратного) буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 2.5 мМ MgCl2 (таблица 1). Помещали образцы в многоканальный программируемый термоциклер (амплификатор) CFX Real-Time PCR Systems (Bio-Rad). Инкубация происходила при заданном температурном режиме (таблица 2).
Вещества |
Одна проба (мкл) |
9 проб (мкл) |
Геномная ДНК |
1 |
9 |
dNTP |
1.5 |
13.5 |
Буфер 10x |
2.5 |
22.5 |
Mg2+ |
2.5 |
22.5 |
Прямой праймер |
0.3 |
2.7 |
Обратный праймер |
0.3 |
2.7 |
Taq-полимераза |
0.5 |
4.5 |
H20 |
16.4 |
147.6 |
Общий объем |
25 |
225 |
Таблица 1. Пример прописи для ПЦР реакции для 1 и для 9 пробирок общего объема смеси 25 мкл.
Название стадии |
Температура, °C |
Время, с |
Число циклов |
Предварительная денатурация |
95 |
90 |
1 |
Денатурация |
95 |
50 |
35 |
Отжиг |
56-68 |
40 |
|
Элонгация |
72 |
45 |
|
Ф Таблица 2. Пример программы амплификации для ПЦР.
инальная элонгация |
72 |
180 |
1 |