ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

ОБЩЕОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА

МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И СОЦИАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Медико-биологический факультет

Отчет о лаборантской практике

Выполнил: студент 571группы

отделения биофизики

Жанин И.С.

Место прохождения практики: Научный центр здоровья детей Российской академии медицинских наук, лаборатория мембранологии с группой генетический исследований

Руководитель практики: Корниенко В. _____________________________

Научный консультант: Д.м.н. профессор Пинелис В.Г._________________

Москва 2011

Оглавление

1.Введение 3

2.Материалы и методы 6

2.1Материалы 6

2.1.1 Используемые приборы 6

2.1.2 Готовые наборы реагентов 6

2.1.3 Ферменты 6

2.1.4 Растворы 7

2.2Методы 7

2.2.1 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови методом высаливания 7

2.2.2 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови при помощи AxyPrep Blood Genomic DNA Miniprep Kit. 8

2.2.3 Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 8

2.2.4 Электрофорез ПЦР-продуктов в 1,5% агарозном геле. 11

2.2.5 Очистка ПЦР продукта. 12

2.2.6 Секвенирование. 14

2.2.7. ПЦР в реальном времени. 17

22

3.Результаты и обсуждение 23

4.Выводы 29

5. Список литературы 30

1.Введение

Синдром Фукуямы - врождённая мышечная дистрофия, одно из наиболее распространённых в странах Азии аутосомно-рецессивных заболеваний (1:188 носителей в Японии, 1:935 в Корее, по России нет точной статистики). Этиология. Причиной заболевания является повреждение гена FKTN, кодирующего трансмембранный белок фукутин, локализованного на цис-полюсе комплекса Гольджи. Этот белок участвует в процессе гликозилирования α-дистрогликана в скелетных мышцах. Ген FKTN локализован на длинном плече 9 хромосомы (9q31-33), состоит из более чем 100 kb, содержит 10 экзонов. Основные мутации, приводящая к возникновению заболевания, – инсерция ретранспозонов в 3’ нетранслируемой области гена, миссенс, нонсенс мутации, 1-bp инсерция (наиболее частая - insA в 9 экзоне), L1 инсерция (L1-РНК полимераза 2 промотор, повторы в 7 интроне).

Патогенез. Существует несколько теорий патогенеза синдрома Фукуямы:

1) «Неупакованный» белок фукутин может проникать через аппарат Гольджи. Локализуясь в экстраклеточном матриксе, фукутин взаимодействует и усиливает комплекс внутренних и внешних мышечных мембран. Сам фукутин может вызывать дистрофию по неизвестному механизму. Лиссэнцефалия развивается под действием комплекса генов, включающих FKTN, DCX, LIS1, RELN.

2) Дистрофин–ассциируемые белки, такие как альфадистрогликан (DAG1), низко экспрессируются при синдроме Фукуямы. DAG1 – поверхностный клеточный белок, который участвует в формировании экстраклеточного матрикса мышц, головного мозга, периферических нервов, соединяя базальную ламину с белками цитоскелета. У больных с синдромом Фукуямы было обнаружено уменьшение количества DAG1 в кортексе и гликозилирование этого белка в скелетных и кардиальных мышцах. При этом уровень бетадистрогликанов оказался в норме. Было высказано предположение, что фукутин участвует в гликозилировании DAG1, тем самым уменьшая его активность.

3) Существует структурная предрасположенность к отставанию в развитии мышечных волокон – повреждение гена, кодирующие тяжелые цепи миозина (MYH1, MYH2, MYH7), миогенные (MRF4, MYOD1) и up-регуляторные факторы (MYOG). Гистологические и микроскопические исследования показали наличие аберрантных нервно-мышечных соединений с несколькими синаптическими складками и вторичными клефтами. Все это приводит к смешаной дистрофии (дистрофия волокон и наличие аберрантных нервно-мышечных соединений), отличающейся по патогенезу от миодистрофии Дюшена.

Симптомы. Первые признаки возникают с рождения до 8 месяцев.

1. Генерализованная мышечная гипотония (больше выражена в проксимальных отделах конечностей)

2. Задержка темпов моторного и психо-речевого развития

   1. При тяжелом течении - больной сам не может ни сидеть, ни ходить

   2. При умеренно выраженном прогрессировании болезни – больной передвигается сам, «утиная» походка, схожая с прогрессирующей миодистрофией Дюшена

3. Контрактуры в крупных суставах рук и ног (время возникновения зависит от скорости прогрессирования заболевания)

4. Выраженая олигофрения

5. Атрофия зрительных нервов и патология сетчатки

6. Лиссэнцефалия

7. Миокардиофиброз

Диагностика.

1. МРТ – пороки развития головного мозга, лиссэнцефалия, гидроцефалия, микрополигирия, аплазия мозолистого тела, уменьшение плотности белого вещества.

2. ЭЭГ – дизритмии, фокальные спайки

3. ЭМГ(Электромиография) – первично-мышечный характер поражения

4. Патоморфологическое исследование – фиброглиальная пролиферация оболочек мозга и гипоплазия кортико-спинального тракта

5. Молекулярно-генетическое обследование – различные мутации гена FKTN

Прогноз и лечение. Для детей с лиссэнцефалией прогноз варьируется в зависимости от степени изменения мозга. Многие дети отстают в развитии. Их уровень интеллекта остается на уровне 3-5 месячных младенцев. Некоторые достигают почти нормального развития интеллекта. Современные лекарства и уход позволяют некоторым детям доживать до подросткового возраста.

Наиболее распространенная причина смерти – проблемы с дыханием.

Для подтверждения диагноза кровь была передана в лабораторию мембранологии с группой генетических исследований центра здоровья детей РАМН.

Цель работы – разработка метода диагностики синдрома Фукуямы.

Задачи работы:

1. Применение метода секвенирования для нахождения мутаций в гене FKTN

2. Применение метода ПЦР и ПЦР в реальном времени для нахождения инсерции в 3’ нетранслируемой области;