2.2.5 Электрофорез пцр-продуктов в 8%-ном пааг

Гель-электрофорез – метод разделения смеси молекул ДНК по размеру. Он основан на том, что молекулы ДНК в буферном растворе заряжены отрицательно и под действием электрического поля движутся к аноду. Если электрофорез проводится в агарозном или полиакриламидном геле, то поры геля обладают эффектом сита, и в результате малые молекулы движутся к аноду быстрее, чем большие. Разделяющая способность геля зависит от размера пор, который в свою очередь, зависит от концентрации геля. Например, в 5%-й агарозный гель позволяет фракционировать молекулы ДНК размером 100-500 п.н., в то время как в 0,5%-м можно разделить молекулы размером 5-20 тыс. п.н. Полиакриламдные гели (ПААГ) используются для фракционирования фрагментов ДНК меньшего размера, вплоть до фрагментов, различающихся между собой на несколько нуклеотидов. Положение отдельных молекул ДНК при электрофорезе в ПААГ оценивают с помощью красителей бромфенолового синего и ксиленцианола.

В настоящей работе разделение ПЦР-продуктов по молекулярной массе проводили с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ следующего состава: 12,6 мл 30%-го раствора акриламида, 2,25мл 10кратного буфера ТБЕ, 29,3 мл дистиллированной воды, 900мкл 10%-го раствора АПС, 30мкл ТЕМЕД. Электрофорез проводили при напряжении 400 В с использованием камеры для вертикального фореза (“Хеликон”, Москва) в течение 1-1,5 часов (рис. 2,3). Визуальный контроль миграции ПЦР-продуктов осуществли относительно положения красителей бромфенолового синего и ксиленцианола.

4

3

2

1

Рис. 2. Пример метилчувствительной ПЦР.1 - пробы 2 – отрицательный контроль, 3 – положительный контроль, 4- маркер молекулярного веса (плазмида рUC19/Msp1), стрелкой указан образец с метилированием,

4

3

2

1

Рис. 3. Отработка условий для локусов с различной длиной ПЦР-продуктов. 1 – GSTT1 (456 п.н.), 2 – CYP1А1 (187 п.н.), 3 – участок гена EPHX1 (163 п.н.), 4- маркер молекулярного веса (плазмида рUC19/Msp1)

2.2.6 Определение мутаций методом sscp

Метод обнаржения мутаций путем оценки конформационного полиморфизма одноцепочных фрагментов ДНК (SSCP – single-strand conformation polymorphism) основан на том, что отдельные цепи денатурированных фрагментов ДНК образуют вторичную структуру, особенности которой зависят от последовательности нуклеотидов. Конформация одноцепочных фрагментов ДНК, образовавшихся во время их рефолдинга (сворачивания после тепловой денатурации при быстром охлаждении, при котором большинство фрагментов остается в одноцепочной форме), влияет на электрофоретическую подвижность фрагментов. Наличие в анализируемом фрагменте ДНК изменений в нуклеотидной последовательности приводит к формированию специфической вторичной структуры, которая будет отличаться от структуры фрагментов ДНК дикого типа, и обладать аномальной подвижностью при электрофорезе, образуя отдельную полосу в геле.

Метод оценки конформационного полиморфизма одноцепочных фрагментов ДНК позволяет выявить до 80% мутаций, но не дает возможности их идентифицировать. Поэтому после выявления фрагментов с аномальной подвижностью проводят их секвенирование.

Разделение ПЦР продуктов по молекулярной массе в собственном эксперименте проводили с помощью вертикального электрофореза в 8%-ном ПААГ (рис. 4). Электрофорез проводился при напряжении 300 В с использованием камеры для вертикального фореза (“Хеликон”, Москва) в течение 5-6 часов. Визуальный контроль миграции ПЦР осуществляся относительно положения красителей бромфенолового синего и ксиленцианола.

Рис.4. Фрагмент 8% ПААГ для SSCP анализа. Стрелкой указан фрагмент с аномальной подвижностью.