2.1.5 Прочие реактивы

1. ТЕМЕД (“ДИА-М”, Россия)

2. 10%-ый раствор персульфата аммония (АПС)

2.2Методы

2.2.1 Выделение днк из лейкоцитов периферической крови

1. К 700 мкл венозной крови добавляли 700 мкл бидистиллированной воды и центрифугировали в течение 15 мин при 12 тыс. об. мин;

2. Супернатант удаляли, оставшийся осадок растворяли в 1000 мкл бидистиллированной воды и центрифугировали 15 мин при 12 тыс. об. мин;

3. Снова удаляли супернатант, оставшийся осадок растворяли в 270 мкл 0,2М растворе ацетата натрия. Добавляли 40 мкл 10% раствора додецилсульфата натрия и перемешивали переворачиванием;

4. Добавляли 150 мкл хлороформа и 300 мкл насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивали смесь переворачиванием. Пробу центрифугировали в течение 15 мин со скоростью 12 тыс. об. мин., затем отбирали супернатант в отдельную пробирку;

5. К супернатанту добавляли 2,5 объема этанола 96% и выдерживали образец 30 мин при температуре -20° С, перемешивали переворачиванием;

6. Образовавшийся осадок вынимали с помощью стеклянной палочки, высушивали при температуре 60° С и растворяли в бидистиллированной воде;

2.2.2 Выделение днк из тканей

1. Фрагмент ткани размером 3мм³ отмывали фосфатно-солевым буфером (1 мл) и гомогенизировали;

2. К гомогенату добавляли 0,7 мл экстракционного буфера (10мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,5% SDS, 4мМ NaCl, pH=8,0) и 40 мкл протеинкеназы К (20мг\мл). Образцы тщательно перемешивали;

3. Инкубировали полученную смесь 10-15 часов при 45° С;

4. Последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа, хлороформа;

5. К образцу добавляли 1\10 объема 5 М ацетата натрия, рН=5,3 перемешивали и осаждали ДНК 2,5 объемами холодного 96%-го этанола, выдерживая образец 30 мин при температуре -70° С;

6. Пробу центрифугировали при 20°С 15 мин с частотой 12 тыс.об.мин. Высушивали осадок ДНК и растворяли в 200 мкл буфера ТЕ(10мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН=8.0).

2.2.3 Выделение днк из парафиновых блоков

1. Срезы парафинизированной ткани толщиной 20 мкм сначала инкубировали по 10 минут в 3 сменах ксилола, затем в 96%-ном этаноле, 70%-ном этаноле, и бидистиллрованной воде;

2. Депарафинизированную ткань высушивали и добавляли к ней 300 мкл экстракционного буфера и 15 мкл 20%-го раствора протеиназы К, после чего инкубировалии 10-15 часов при 45° С;

3. Последовательно проводили экстракцию равным объемом фенола, фенол-хлороформа, хлороформа;

4. После обработки хлороформом к супернатанту добавляли 2,5-кратный объем охлажденного 96%-го этанола и выдерживали образец 20 мин при температуре -20° С;

5. Пробу центрифугировали 15 минут со скоростью 12 тыс.об. мин., затем промывали осадок 70%-ым этанолом;

6. Высушивали осадок ДНК и растворяли в 30 мкл бидистилированной воды.

2.2.4Полимеразная цепная реакция (пцр)

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - осуществляемая in vitro специфическая амплификация нуклеиновых кислот, инициируемая синтетеческими олигонуклеотидными праймерами. ПЦР состоит из тепловой денатурации геномной ДНК, ее отжига с праймерами и удлинения цепи (элонгации); смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси. В ходе ПЦР происходит экспоненциальное увеличение количества копий амплифицируемой последовательности. Благодаря этому последовательности, присутствующие в клиническом препарате в минимальном количестве (одна или несколько копий) и не поддающиеся обнаружению никакими другими методами, легко выявляются с помощью ПЦР. Экспоненциальное увеличение числа копий молекулы-мишени не только связано с высокой чувствительностью метода, но и облегчает их выявление, а дизайн праймеров, комплементарных только амплифицируемому участку генома, обеспечивает специфичность реакции. Каждый раунд ПЦР занимает от 2 до 5 минут, и обычно для достижения необходимой чувствительности достаточно 25-35 раундов, т.е. 1,5-2 часа. Таким образом, весь анализ можно провести в течение одного дня.

1. Денатурация - в эту стадию происходит разлделение матричной ДНК на отдельные цепи. Температура денатурации устанавливается в пределах 94°-96° С и зависит от содержания GC связей (наиболее прочных);

2. Связывание (отжиг) праймеров – в эту стадию происходит спецефическое связывание (отжиг) праймера с комплементарной ему частью матричной ДНК. Температура отжига определяется по специальной формуле T(отжига)=2∙(t+a)+4∙(g+c), где t,a,g,c – количество соответствующих нуклеотидов в праймере. Эта формула имеет ограничения – может использоваться только при длинах праймеров до 15 п.н. При большей длине праймеров пользуются более точной формулой, представленной ниже :

T(отж)= 64,9°С +41°С(g+c - 16,4)\N , где N – длина праймера(п.н.) ;

3. Элонгация (удлинение) праймеров при синтезе ДНК – в эту стадию происходит удлинение праймеров на матричной последовательности в соответствии с принципом комплементарности исходной и синтезируемой цепей с участием фермента термостабильной Taq-полимеразы. Оптимальная температура - 72° С. Основные этапы ПЦР изображены на рис. 1.

Рис.1. Принцип полимеразной цепной реакции. Двухцепочечную ДНК-матрицу денатурируют (разделяют на отдельные цепи) и проводят отжиг с двумя праймерами. Праймеры присоединяются к противоположным цепям навстречу друг другу, определяя границы целевого амплифицируемого фрагмента. В процессе достройки праймеров происходит копирование участка ДНК, расположенного между двумя праймерами, и в результате количество матрицы удваивается. Цикл реакций денатурации матрицы, отжига и удлинения праймеров повторяется 25-35 раз. При избытке праймеров и других компонентов реакции после 25 циклов теоретически может получиться более 8 млн копий фрагмента

В ходе собственного эксперимента к 1,5 мкл геномной ДНК добавляли 0,3 мкл каждого праймера (табл. 2), 1,5 мкл эквимолярной смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), 1ед Taq-полимеразы, 5 мкл 5-ти кратного (или 2,5 мкл 10-ти кратного) буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8,4), 2.5 мМ MgCl₂ (табл. 1). Затем наслаивали 30 мкл вазелинового масла. Помещали образцы в многоканальный программируемый термоциклер (амплификатор) ТЕРЦИК (ЗАО “НПФ ДНК-Технология”, Россия). Инкубировали при следующем температурном режиме:

1) 95° С – 1,5 мин;

2) (95° С – 50с, 61° С – 40с, 72° С – 30с) 35 циклов;

3) 72° С – 3мин.

Таблица 1.

Вещества	Одна проба	20 проб
Геномная ДНК	1,5	-
dNTP	1.5	30
Буфер(с 1,5 мМ Mg 2+)	5	100
Прямой праймер	0.3	6
Обратный праймер	0.3	6
Taq-полимераза	1	20
H20	15.4	308
Общий объем	25

Таблица 2.

Название		Последовательность. 5'→3’	Длина ПЦР-продукта, п.н
1-ый экзон	VHLex1-F	tgg-tct-gga-tcg-cgg-agg-gaa-t	416
	VHLex1-R	ggc-ttc-aga-ccg-tgc-tat-cg
2о-й экзон	VHLex2-F	acc-ggt-gtg-gct-ctt-taa-caa-cc	227
	VHLex2-R	tca-agt-ggt-cta-tcc-tgt-act-tac
3-ий экзон	VHLex3-F	tgc-cac-tga-gga-ttt-ggt-ttt-tgc	250
	VHLex3-R	aaa-gct-gag-atg-aaa-cag-tgt-aag