ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

РОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Медико-биологический факультет

Отчет о лаборантской практике

Выполнил: студент 371группы

отделения биофизики

Жанин И.С.

Место прохождения практики: лаборатория эпигенетики Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетический научный центр РАМН

Руководитель практики: к.м.н., с.н.с. Михайленко Д.С. ________________

Работа оценивается на _________________

Москва 2010

Оглавление

1.Введение 3

2.Материалы и методы 4

2.1Материалы 4

2.1.1 Используемые приборы 4

2.1.2 Готовые наборы реагентов 4

2.1.3 Ферменты 4

2.1.4 Растворы 4

2.1.5 Прочие реактивы 5

2.2Методы 5

2.2.1 Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови 5

2.2.2 Выделение ДНК из тканей 5

2.2.3 Выделение ДНК из парафиновых блоков 6

2.2.4Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 6

2.2.5 Электрофорез ПЦР-продуктов в 8%-ном ПААГ 8

2.2.6 Определение мутаций методом SSCP 10

2.2.7 Окрашивание ПААГ нитратом серебра 11

3.Результаты и обсуждение 12

4.Выводы 13

5. Список литературы 14

1.Введение

Ежегодно в мире регистрируется около 200 тыс. новых случаев рака почки и 100 тыс. смертей от этого заболевания, что позволяет считать его одной из основных проблем современной онкоурологии. Подавляющее число случаев рака почки представлено спорадическими опухолями.

Соматические мутации гена VHL происходят в 40-60% случаев наиболее частого морфологического типа рака почки – светлоклеточной карциномы. Белок VHL необходим для сборки мультипротеинового комплекса, в котором осуществляется убиквитин-зависимая деградация гипоксией индуцируемого фактора 1а (HIF1-a). При мутации в гене VHL нарушается формирование убиквитин-лигазного комплекса. Это приводит к нарастанию в клетках HIF1-a и аномально высокой экспрессии гипоксией индуцируемых генов. Известны такие гены мишени HIF1-a, как факторы роста VEGF, PDGF и их рецепторы, которые участвуют в положительной регуляции клеточной пролиферации и ангиогенезе. Предполагается, что гиперэкспрессия этих генов лежит в основе развития VHL-ассоциированных опухолей.

Целью работы было определение в образцах светлоклеточного рака почки мутаций VHL.

Задачи работы:

1. Освоение метода ПЦР;

2. Применение метода и разных его модификаций для нахождения мутаций;

3. Овладение навыками работы с амплификаторами, приборами для фореза.

2.Материалы и методы

2.1Материалы

2.1.1 Используемые приборы

1. Прибор для вертикального электрофореза VE-4M (“Helicon”, Россия).

2. Многоканальный программируемый термоциклер (амплификатор) ТЕРЦИК (ЗАО “НПФ ДНК-Технология”, Россия).

3. Универсальная микроцентрифуга Centrifuge 5414 (“Eppendorf”, Германия).

4. Вортекс MINIGEN TYPE 4TEC.

5. Генетический анализатор ABI PRISM 3100 (“Applied Biosystems”, США)

2.1.2 Готовые наборы реагентов

1. 10х реакционный буферный раствор для амплификации

2. Набор для секвенирования ABI PRISM^® BigDye™ Terminator v. 3.1

2.1.3 Ферменты

1. Taq-полимераза (“Бионем”, Россия)

2. Эндонуклеаза рестрикции NotI (“Fermentas”, Литва)

3. Метилчувствительная эндонуклеаза BstHHI (“СибЭнзим”, Россия)

2.1.4 Растворы

1. Экстракционный буфер: 10мМ Tris-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,5% SDS, 4мМ NaCl, pH 8,0, деионизированной воды до 1 л.

2. 30%-ный раствор акриламида; 145 г акриламида, 5 г N,N-метиленбисакриламида, до 0,5 л дистиллированной воды.

3. Буфер TBE: 108 г Tris-основного, 55 г борной кислоты, 40 мл 0,5 М ЭДТА, перед использованием развести в 10 раз.

4. Буфер для внесения в гель : 300 мкл глицерина, по 0,25 г бромфенолового синего и ксиленцианола, до 1 мл дистиллированной воды.

5. Раствор нитрата серебра (0,9%): 0,9г AgNО₃ на 1 л дистиллированной воды.

6. Проявитель: 30г сухого гидроксида натрия, 15 мл формалина, до 1л дистиллированной воды