2.6. Антисмысловые рнк бактерий; потенциальная роль в регуляции гена fur
В настоящее время изучение пост-транскрипционной регуляции генов с участием некодирующих РНК (нкРНК) является одним из наиболее активно развивающихся направлений биологии. Ранее транскриптомы прокариот считали простыми, поскольку их геномы практически целиком состоят из генов, кодирующих белки, рибосомные РНК и транспортные РНК. Однако современные полногеномные исследования выявили у них масштабную транскрипцию генных и межгенных участков, а также участков ДНК, комплементарных кодирующим последовательностям (антисмысловые РНК, асРНК) (Rasmussen et al., 2009; Dornenburg et al., 2010; Mitschke et al., 2011). В целом нкРНК существенно преобладают у бактерий, как, например, у цианобактерии Synechocystis 6803, у которой они составляют до 65% всех выявленных транскриптов (Mitschke et al., 2011).
Природные асРНК были впервые обнаружены у бактерий более 30 лет назад (Itoh, Tomizawa, 1980; Lacatena, Cesareni, 1981), а для бактериофага λ постулированы еще раньше (Spiegelman et al, 1972). О первом случае антисмысловой регуляции экспрессии генов у архей стало известно в 1993 году, когда у фага H экстремально галофильной археи Halobacterium salinarium выявили асРНК, комплементарную первым 150 нуклеотидам транскрипта T1 (Stolt, Zillig, 1993). Сначала несколько изученных хромосомных, плазмидных и фаговых асРНК прокариот считали скорее исключением, чем правилом. Однако эти примеры показали, что природные асРНК присутствуют во всех трех царствах живого, хотя в последние годы их исследовали в основном у эукариот. Современные данные позволяют полагать, что регуляция экспрессии генов с помощью асРНК представляет собой особый уровень управления геномом.
Молекулярные механизмы действия асРНК у бактерий
В то время как знание о количестве асРНК у отдельных бактерий быстро растет, информация о молекулярных механизмах их действия накапливается значительно медленнее. Между тем хорошо изучены функциональные свойства нескольких асРНК бактериофагов и плазмид, а также многих транс-действующих нкРНК (Brantl, 2007).
Изменение стабильности РНК-мишени. Взаимодействие асРНК с РНК-мишенью приводит к изменению вторичной структуры обеих взаимодействующих молекул и образованию формы дуплексной РНК. Эти структурные изменения по-разному влияют на стабильность и период полураспада РНК. В некоторых случаях следствием образования дуплекса является быстрая и полная деградация обеих РНК. Ярким примером служит асРНК OOP длиной 77 н. фага λ, которая комплементарна 3'-концу мРНК белка CII, активатора функции репрессора CI. Сверхэкспрессия OOP приводит к расщеплению мРНК CII РНКазой III, первоначально на двух участках: один в 3'-конце кодирующей области и один в области между генами CII и О (Krinke, Wulff, 1990; Krinke et al., 1991).
Взаимоисключение асРНК и мРНК. Хорошо изученным примером кодеградации является пара IsiA/IsrR, смысловая/антисмысловая РНК Synechocystis 6803 (Dühring et al., 2006). Белок IsiA участвует в стрессовом ответе и приводит к существенной реорганизации фотосинтетического аппарата, формированию кольцевой структуры вокруг фотосистемы I (Dühring et al., 2006). Таким образом, синтез РНК IsiA должен быть подвержен строгой регуляции, которая отчасти достигается за счет асРНК IsrR (рис. 2). Эти два транскрипта накапливаются в обратной зависимости друг от друга, и, следовательно, обе РНК практически существуют в виде взаимоисключающих друг друга структур. АсРНК IsrR транскрибируется с конститутивного промотора, в то время как транскрипция гена isiA индуцируется недостатком железа, окислительным или световым стрессом. Когда присутствуют обе РНК одновременно, они образуют РНК-дуплексы, которые немедленно расщепляются по неизвестному механизму. Таким образом, информация гена isiA не может быть реализована, пока молекулы мРНК IsiA не оттитруют все молекулы асРНК IsrR. Избыточная концентрация и асРНК IsrR, и комплементарного ей участка мРНК IsiA, реципрокно приводит к разрушению соответствующего антагониста. Интересно, что сами по себе эти одноцепочечные молекулы РНК являются очень стабильными; период полураспада IsrR более 45 мин (Legewie et al., 2008). В результате асРНК IsrR вызывает не только задержку экспрессии гена isiA в ранней фазе стресса, но и быстрое истощение мРНК IsiA в период восстановления после стресса, когда транскрипция гена isiA прекращается. Такая регуляция известна как механизм "порогового линейного отклика" (Legewie et al., 2008).
Рис. 2. Физическая карта промоторов и генов мРНК IsiA и асРНК IsrR (А), а также схема взаимоисключения этих РНК в норме и при стрессе у Synechocystis 6803 (Б). Линия-пунктир – потенциальная кривая синтеза-распада мРНК IsiA в отсутствие IsrR. Заимствовано из работ Dühring et al., 2006 (А) и Legewie et al., 2008 (Б).
Процессинг и стабилизация мРНК с участием асРНК. Взаимодействие мРНК и асРНК не обязательно приводит к их деградации. РНК-дуплекс может также генерировать специфический сайт процессинга, что приводит к поступательной инактивации мРНК, либо формированию зрелой или стабилизированной мРНК. АсРНК GadY у E. coli участвует в ответе на кислотный стресс. Ген асРНК GadY расположен в 3'-конце гена gadX, который является активатором глутамат-зависимой системы устойчивости к кислотам (Opdyke et al., 2004). АсРНК GadY контролирует уровень мРНК GadX, вызывая расщепление бицистронной мРНК GadXW. Разделенные мРНК GadX и GadW обладают повышенной стабильностью (Opdyke et al., 2011). Было показано, что в процессинг мРНК GadXW могут быть вовлечены РНКаза E (Takada et al., 2007) и РНКаза III (Opdyke et al., 2011). Не исключено, что данный пример иллюстрирует весьма распространенный механизм позитивной регуляции генов с участием асРНК.
Взаимодействие между асРНК и РНКазой Е. Описан пример защиты мРНК, с 5’-участком которой взаимодействует асРНК, от расщепления РНКазой Е in vitro (Mackie, 1998). В клетках цианобактерии Prochlorococcus MED4, инфицированной фагом P-SSP7, большинство хозяйских мРНК обладает меньшим периодом полураспада, чем в неинфицированных клетках. Вероятно, такое состояние поддерживается усилением активности хозяйской РНКазы Е, о чем свидетельствует повышенный уровень ее мРНК (Lindell et al., 2007). Интересно, что некоторые мРНК, содержание которых было повышено в инфицированных клетках, имеют большие асРНК (до 7 т.н.), которые также были индуцированы. Взаимодействие длинных асРНК с полицистронными мРНК маскировало сайты расщепления РНКазой Е и предотвращало деградацию (Stazic et al., 2011). Вместе с тем существует пример деградации мРНК РНКазой Е при участии асРНК в системе AmgR/mgtC у S. enterica (Lee, Groisman, 2010).
Терминация транскрипции мРНК. Существуют также механизмы действия асРНК, не относящиеся к пост-транскрипционным, поскольку проявляются непосредственно на уровне транскрипции. Система транспорта железа у V. anguillarum кодируется опероном, который включает в себя четыре гена транспортеров сидерофоров (fatDCBA), два гена биосинтеза сидерофоров (angR and angT), а также две асРНК (RNAα и RNAβ). Обе асРНК негативно регулируют оперон при высокой концентрации железа (Chen, Crosa, 1996; Salinas, Waldbeser, Crosa, 1993; Waldbeser , Chen, Crosa , 1995; Waldbeser et al., 1993). В то время как асРНК RNAα подавляет экспрессию генов fatA и fatB, асРНК RNAβ определяет дифференциальную транскрипцию всего оперона fatDCBA-angRT и укорочение мРНК FatDCBA (Stork et al., 2007). АсРНК RNAβ комплементарна 3′-концу гена fatA и 5'-концу angR, и ее связывание с растущей мРНК FatDCBA приводит к терминации транскрипции на потенциальной шпильке вблизи стоп-кодона гена fatA. То же происходит при добавлении RNAβ in vitro, что исключает другие механизмы регуляции, такие как ко-деградацию или транскрипционную интерференцию (Stork et al., 2007).
Другим примером служит контроль экспрессии гена вирулентности icsA (virG) асРНК RnaG у патогенной бактерии Shigella flexneri. Эта асРНК подавляет транскрипцию, используя механизм транскрипционной интерференции. На 5’-конце мРНК IcsA образуются две длинные шпильки с функцией антитерминатора. Связывание асРНК с транскрибирующейся мРНК препятствует образованию антитерминатора и способствует образованию шпильки, терминирующей транскрипцию (Giangrossi et al., 2010).
Нарушение трансляции. В ряде случаев деградация РНК имеет второстепенное значение при подавлении экспрессии генов. Примером служит регуляция с участием асРНК SymR синтеза SOS-белка SymE энтеробактерий, который не синтезируется в нормальных условиях. Данная асРНК перекрывает 5’-конец мРНК SymE, в том числе сайт связывания рибосомы и стартовый кодон, и препятствует инициации трансляции (Kawano et al., 2007). Такой тип негативного контроля возможен для многих асРНК, которые перекрывают сайт связывания рибосомы или стартовый кодон мРНК.
Активация трансляции. У цианобактерии Synechocystis 6803 идентифицирована асРНК РsbA2R, комплементарная мРНК РsbA2, кодирующей белок D1 фотосистемы II. У мутантов с инактивированной асРНК РsbA2R замедлен рост при сильном освещении и снижено содержание белка D1. Установлено, что на 5’-конце мРНК РsbA2 имеет два сайта РНКазы Е, и образование дуплекса с асРНК защищает ее от разрезания. Предполагают, что первый сайт РНКазы Е защищается асРНК, а второй – рибосомой (Sakurai, 2012).
Регуляторные функции асРНК в ответ на внешние сигналы
Известно много примеров, когда условия среды влияют на экспрессию асРНК. Уровень различных асРНК реагирует на инфицирование фагом и степень освещения у цианобактерии Prochlorococcus MED4 (Steglich et al., 2007; Stazic et al., 2011), изменяется при споруляции у B. subtilis (Silvaggi et al., 2006), реагирует на изменения в потреблении СО2, условия освещения и доступность железа у Synechocystis 6803 (Dühring et al., 2996; Georg et al., 2009; Mitschke et al., 2011). У грамположительной бактерии Clostridium acetobutylicum транскрипция асРНК MccA контролируется наличием серы, и, соответственно, эта асРНК регулирует оперон, отвечающий за метаболизм серы (André et al., 2008). АсРНК IsrR зависимо от железа контролирует экспрессию гена isiA, вовлеченного в гомеостаз железа у Synechocystis 6803 (Dühring et al., 2006). У H. pylori при нейтральном рН асРНК подавляет оперон ureAB, кодирующий уреазу, необходимую для выживания патогена в кислой среде (Wen et al., 2011).
К настоящему времени экспериментально изучено несколько асРНК, комплементарных мРНК гена fur у одноклеточных и нитчатых цианобактерий (Hernandez et al., 2006; Sevilla et al., 2011). Показано, что делеция гена асРНК α-fur у Anabaena 7120 приводит к повышению внутриклеточной концентрации железа, нарушению структуры тилакоидов и снижению эффективности фотосинтеза (Hernandez et al., 2010). Аналоги генов α-fur обнаружены у цианобактерий M. aeruginosa (Sevilla et al., 2011) и Synechocystis 6803 (Martin-Luna et al., 2011). Однако потенциальные механизмы регуляторных взаимодействий (возможно, принципиально различных) между асРНК и геном fur у цианобактерий остаются невыясненными.