2.3. Специфичность связывания регуляторных белков Fur с днк

Молекулярно-генетический анализ (foot printing) Fur-регулируемых промоторов E. coli показал наличие в них 19-членного палиндрома (9-1-9) GATAATGATAATCATTATC, названного Fur-боксом, с которым связывается димер белка Fur в комплексе с железом (de Lorenzo et al., 1988). Не исключено, что сайтами связывания белка Fur могут также служить 3 гексамерных повтора GATAAT (Escolar et al., 1998). У B. subtilis Fur-бокс содержит гептамерные инвертированные повторы (7-N-7) TGATAATNATTATCA (Baichoo, Helmann, 2002). Два таких повтора, раздвинутых еще на 6 нуклеотидов (7-7N-7), образуют последовательность, в которой содержится классический 19-членный Fur-бокс (Fuangthong, Helmann et al., 2003). Сравнительные исследования промоторов генов, регулируемых различными белками Fur у разных объектов, показали, что для эффективного связывания регуляторного белка с ДНК достаточно 50-80% сходства конкретного сайта с консенсусом Fur-бокса (Baichoo et al., 2002; Sebastian et al., 2002; Thompson et al., 2002). Общим правилом является также наличие в сайтах связывания участков, богатых основаниями А/Т.

В определенных случаях для оптимального связывания белка Fur с ДНК наряду с Fur-боксом требуется наличие дополнительной последовательности нуклеотидов. Например, белок Fur Anabaena 7120 неэффективно связывается с небольшой синтетической последовательностью из 27 нуклеотидов, несмотря на содержание в ней специфичного Fur-бокса (Gonzalez et al., 2011). Вместе с тем известен случай неспецифического взаимодействия белка Fur с промотором гена irr (Fur-бокс отсутствует) у Bradyrhizobium japonicum (Friedman, O’Brian, 2003). Однако в целом следует отметить, что у разных представителей суперсемейства FUR сайты узнавания в ДНК характеризуются заметным сходством (Fuangthong, Helmann, 2003).

2.4. Белок Fur – больше чем глобальный регулятор транскрипции

Выявление все большего количества генов, экспрессия которых контролируется белком Fur у разных видов бактерий, свидетельствует о его роли в качестве глобального регулятора. При этом многие гены предполагаемых Fur-регулонов кодируют гипотетические белки с неизвестными функциями. Способность белка Fur взаимодействовать с гемом и другими сигнальными молекулами, такими как NO и CO, указывает на наличие у него наряду с функцией регулятора транскрипции и других клеточных функций (Igarashi et al., 2011; Pellicer et al., 2012). Не исключено, что он может служить также сенсором редокс-статуса клетки (Botello-Morte et al., 2014). Поскольку потенциально белок Fur взаимодействует in vivo с белками, реагирующими на окислительный стресс, предполагают, что он участвует в транспорте электронов, в частности, у цианобактерий (Fillat, 2014).

Роль белка Fur в гомеостазе железа, в контроле вирулентности и в адаптивных ответах клетки

Белки Fur контролируют метаболизм железа у подавляющего большинства прокариот за исключением ряда грамположительных бактерий, например, Mycobacterium spp., и архей, у которых такой контроль осуществляют белки семейства DtxR (Gold et al., 2001; Hantke, 2001; Andrews et al., 2003; Louvel et al., 2009; Zhu et al., 2013). В аэробных условиях железо находится в труднорастворимой окисленной трехвалентной форме, и для ассимиляции трехвалентного железа, часто представленного в среде в следовых концентрациях, бактерии используют высоко аффинные внеклеточные хелаторы железа, называемые сидерофорами (Zhu et al., 2013). В настоящее время генетический контроль транспорта железа, как в свободном виде, так и в комплексе с сидерофорами, довольно хорошо изучен, особенно у E. coli. Показано, что в условиях достатка железа белок Fur репрессирует гены транспорта двухвалентного железа и гены белков Bfr, FtnA и FtnB, участвующих в его запасании. Более того, он репрессирует все гены биосинтеза и транспорта сидерофоров, включая их рецепторы Cir, FecA, FepA, FhuA, FhuE и Fiu в наружной мембране и АВС-транспортеры FecBCDE, FepBCDEFG и FhuBCD в цитоплазматической мембране (Earhart, 1996).

Поскольку основным препятствием развития патогенных бактерий в организме-хозяине является низкая концентрация железа, гены систем транспорта железа служат для них истинными факторами вирулентности, а регулирующий их ген fur – ассоциированным фактором вирулентности. В качестве примера можно привести fur-зависимый кластер генов Staphylococcus aureus, который содержит 7 генов (isdA-G), кодирующих белки транспорта и деградации гема, и ген сортазы (srtB), прикрепляющей наружные белки-транспортеры к клеточной стенке (Marraffini et al., 2008). Выяснение роли белка Fur в контроле вирулентности патогенных бактерий является актуальной задачей современных исследований (Carpenter et al., 2009; Troxell et al., 2013). В частности, показано его участие в регуляции продукции токсинов бактериями Vibrio spp. (Kim et al., 2013; Mey et al., 2005), P. aeruginosa (Ochsner et al., 1995) и Legionella pneumophila (Allard et al., 2006), а также цианобактерией Microcystis aeruginosa (Sevilla et al., 2008). Установлено, что нормальное функционирование гена fur у H. pylori необходимо для успешной колонизации клеток модельных организмов, таких как песчанка и мышь (Bury-Mone et al., 2004; Gancz et al., 2006), а дефект этого гена у Campylobacter jejuni приводит к невозможности колонизировать желудочно-кишечный тракт цыпленка (Palyada et al., 2004). Нарушение экспрессии гена fur является причиной ослабленной вирулентности мутантных штаммов S. aureus (Horsburgh et al., 2001; Torres, et al., 2010), Listeria monocytogenes (Rea et al., 2004) и V. cholerae (Mey et al., 2005). С помощью молекулярно-генетического анализа (ДНК-микроэррэй в сочетании с футпринтингом) выявлен спектр Fur-регулируемых генов, связанных с вирулентностью штаммов N. meningitidis и N. gonorrhoeae (Yu, Genco, 2012). Установлено, что белок Fur вовлечен в нейтрализацию активных форм кислорода, вырабатываемых клетками организма-хозяина, а также в устойчивость к кислотам у Salmonella typhimurium (Hal et al., 1996; Gancz et al., 2006), в контроль усвоения рибофлавина у C. jejuni (Crossley et al, 2007) и устойчивость к осмотическому стрессу у Desulfovibrio vulgaris (Bender et al., 2007). У представителей рода Pseudomonas белок Fur связан с формированием биопленок (Banin et al., 2005) и регуляцией чувства кворума, опосредованной некодирующими РНК PrrF1 и PrrF2 (Oglesby et al., 2008), а у P. рseudoalcaligenes участвует в контроле дыхания и обуславливает резистентность к действию цианидов (Becerra et al., 2011). Предполагается, что у Shewanella piezotolerans белок Fur служит сенсором бескислородных условий, косвенно регулируя анаэробное дыхание через белок ArcА (Yang et al., 2013).

У азотфиксирующей цианобактерии Anabaena 7120 белок Fur является основным регулятором гомеостаза железа, а также непосредственно контролирует многие гены, вовлеченные в фотосинтез, дыхание и адаптивный ответ на окислительный стресс (Gonzalez et al., 2010, 2011, 2012). Правильная экспрессия гена fur требуется для полной дифференциации гетероцист (Gonzalez et al., 2013); причем, уровень экспрессии этого гена в гетероцистах значительно выше, чем в делящихся клетках, что, возможно, связано с анаэробиозом (Lopez-Gomollon, Hernandez et al., 2007). Следует также отметить, что экспрессия всех генов, вовлеченных в метаболизм азота, координируется белком Fur и белком NtcA, главным регулятором метаболизма азота у цианобактерий (Lopez-Gomollon, Pellicer et al., 2007).

В совокупности представленные данные свидетельствуют о существенной и, возможно, центральной роли белка Fur в метаболизме прокариот, реализующейся через модуляцию экспрессии множества генов, вовлеченных в различные процессы и адаптивные ответы клетки.

Механизмы репрессии и активации экспрессии генов белком Fur

Исходно полагали, что белок Fur функционирует сугубо как репрессор транскрипции, использующий в качестве кофактора ионы Fe²⁺ (Bagg, Neilands, 1987). Однако все больше фактов свидетельствует о возможности прямого или непрямого позитивного контроля генов белком Fur, а также контроля транскрипции им в апо-форме. У E. coli давно выявлена позитивная регуляция геном fur экспрессии ряда генов железосодержащих белков, в частности, бактериоферритина Bfr и супероксиддисмутазы Fe-SOD (Niederhoffer et al., 1990). В данном случае активация транскрипции опосредована репрессией голобелком Fe²⁺-Fur гена антисмысловой регуляторной РНК RyhB (Masse et al., 2002; McHugh et al., 2003), синтезирующейся соответственно только в условиях недостатка железа и связывающейся с комплементарным участком мРНК негативно регулируемых ей генов-мишеней (Braun, Hantke, 2007). Вместе с тем описан прямой негативный контроль транскрипции апобелком Fur, обнаруженный у патогенной бактерии H. pylori, у которой также наблюдали нарушение синтеза некоторых железосодержащих белков, в том числе Fe-SOD, вследствие инактивации гена fur (Delany et al., 2001). В этом случае экспрессия ортолога гена sodB (Fe-SOD) у H. pylori, в отличие от E. coli, была подвержена непосредственной репрессии белком Fur в отсутствии железа. Позже транскриптомный анализ предсказал наличие у H. pylori апо-Fur-регулона, состоящего из 16 генов, кодирующих белки, участвующие в хранении железа, дыхании, энергетическом обмене и хемотаксисе (Lee et al., 2007).

Хотя вопрос о регуляции генов апобелком Fur у H. pylori остается дискуссионным, существуют экспериментальные указания на то, что в такой форме он регулирует не только гены железосодержащих белков (sodB и prf), но и гены белков, не содержащих железа, например, ген цитохрома c553, содержащего медь (Carpenter et al., 2013). Репрессия некоторых генов апобелком Fur в отсутствие железа отмечена также у D. vulgaris Hildenborough (Bender et al., 2007) и N. gonorrhoreae (Yu, Genco, 2012). Рентгеноструктурный анализ апоформы Fur C. jejuni показал, что в данном случае ДНК-связывающий домен белка развернут на 180° относительно его положения в голодимерах Fe²⁺-Fur других видов (Butcher et al., 2012). Такое различие голо- и апоформ регулятора Fur может указывать на узнавание ими различных последовательностей в промоторах генов-мишеней (Fillat, 2014). Более того, было показано, что апобелок Fur играет роль не только репрессора, но и активатора транскрипции у бактерий C. jejuni (Butcher et al., 2012), N. Gonorrhoeae (Grifantini et al., 2003) и H. pylori (Carpenter et al., 2013). Как и в V. vulnificus, S. typhimurium и многих других апо-форма активирует fur (Lee et al., 2007), регулируемый железом белок IRO-28 (Hall et al., 1996), а также ген множественной лекарственной устойчивости norA у S. aureus (Deng et al., 2012).

Активация генов голобелком Fe²⁺-Fur может осуществляться разными путями, в основном еще мало изученными. Прямая активация может быть связана с конкуренцией между белком Fur и другим репрессором. Так происходит с геном norB, в промоторе которого белок Fur препятствует связыванию репрессора ArsR с сайтом, перекрывающимся с Fur-боксом (Isabella et al., 2008). У E. coli описан механизм опосредованной активации, когда белок Fur сдвигает структурирующий белок, связанный с промотором гена ftnA, открывая, таким образом, доступ РНК-полимеразе (Nanda et al., 2010). Между тем механизм прямой активации транскрипции с участием белка Fur представляется более широко распространенным. Комплекс Fe²⁺-Fur активирует экспрессию гена бактериоферритина bfrB у P. aeruginosa (Wilderman et al., 2004), гена порина OmpT наружной мембраны у V. cholerae (Craig et al., 2011) и гена вирулентности hilD у S. typhimurium (Teixido et al., 2011). У Anabaena 7119 белок FurA играет двойную роль в регуляции транскрипции генов тетрапирольного пути биосинтеза, выступая, с одной стороны, в качестве зависимого от железа репрессора генов hemB, hemC и ho1, а с другой – в качестве зависимого от железа активатора генов hemK и hemH (Gonzalez et al., 2012). Анализ тотального профиля транскрипции у мутанта N. meningitidis с делецией гена fur выявил 38 Fur-активируемых генов (Delany et al., 2006), входящих в состав еще большего числа Fur-зависимых генов, связанных с контролем транспорта и запасания железа, энергетического обмена и адаптивных ответов (Yu, Genco, 2012). Среди 59 генов Fur-регулона H. pylori выявлено 25 позитивно регулируемых генов, включая ген основного флагелина flaB и гены HP0295, fliY, flgK и cheA, контролирующие хемотаксис (Danielli et al., 2006). Последующие исследования также выявили прямую Fur-зависимую активацию гена nifS (Alamuri et al., 2006), гена вирулентности cagA (Pich et al., 2012) и генов оперона oorDABC (Gilbreath et al., 2012). У E. coli Fur-активируемыми оказались гены энергетического обмена, в основном гены железосодержащих белков дыхательных комплексов (McHugh et al., 2003).

Таким образом, активация транскрипции генов белком Fur существенно распространена у различных представителей прокариот. Однако в определенных случаях активация не является прямой, а опосредуется репрессией голобелком Fe²⁺-Fur небольших регуляторных РНК. Открытие первой из таких некодирующих РНК, RyhB, объяснило механизм активации гена железосодержащей супероксиддисмутазы (Fe-SOD) у E. coli и показало, что РНК RyhB тем же способом опосредует Fur-регуляцию генов acnA, fumA и bfr (Masse, Gottesman, 2002). Вместе с тем это открытие вскрыло механизм взаимосвязи между снижением содержания железа в среде и замедлением зависимых от железа метаболических процессов (механизм, названный ответом «запасания железа»). Представления о роли малых некодирующих РНК в регуляции генов белком Fur значительно расширились после обнаружения ортологов RyhB у большого числа бактерий различных родов (http://rfam.xfam.org/family/RyhB#tabview=tab1), таких как Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter и Salmonella, а также у V. cholerae и Yersinia pestis (Oglesby-Sherrouse et al, 2013). Более того, у многих бактерий найдены негомологичные функциональные аналоги РНК RyhB. У грамотрицательных бактерий к таким РНК относятся PrrF1 и PrrF2 P. aeruginosa (Wilderman et al., 2004), NrrF и ArrR Neisseria spp. (Mellin et al., 2007; Ducey et al., 2009; Metruccio et al., 2009) и Azotobacter vinelandii (Jung, Kwon, 2008); а у грамположительных, например у B. subtilis – РНК FsrA (Gaballa et al., 2008). Недавно проведенный полногеномный анализ девяти протеобактерий выявил 38 некодирующих РНК, контролируемых белком Fur, что указывает на широкую распространенность такого механизма непрямой Fur-зависимой регуляции (Sridhar et al., 2013).

Белок Fur в качестве сенсора редокс-статуса клетки

Изменения в содержании железа неизбежно отражаются на редокс-потенциале клетки, поэтому тонкая регуляция метаболизма железа является жизненно важной. Известно, что повышенная экспрессия гена fur может приводить к развитию окислительного стресса (Zheng et al., 1999; Lopez-Gomollon et al., 2009), в связи с чем окисление остатков цистеина в белке Fur, как было установлено у цианобактерий и представителей рода Streptomyces, может иметь адаптивное значение (Fillat, 2014). Показано, что у S. reticulii от состояния остатков цистеина зависит функция белка FurS, который, как и регулятор ответа на окислительный стресс PerR, активируется и ионами Fe²⁺, и Mn²⁺ (de Orue et al., 2000). Однако в целом вопрос о восприятии белком Fur окисления в качестве физиологического сигнала мало изучен (Spiro, D’Autreaux, 2012). Существуют организмы, у которых не идентифицированы ортологи белка PerR, и функцию регулятора ответа на окислительный стресс у них выполняет паралог белка Fur. Так, у Anabaena 7120 белок FurA регулирует экспрессию ряда генов, которые у других организмов находятся под контролем белка PerR; более того, активность FurA явно связана с редокс-потенциалом клетки (Hernandez et al., 2004; Hernandez et al., 2006).

Известно, что белки Fur взаимодействуют с гемом, который катализирует образование АФК и сам служит сигналом окислительного стресса. В качестве кофактора гем связывается с гистидиновыми или цистеиновыми остатками в составе белков и в дополнение к своим редокс функциям может работать как сенсор различных газов, таких как O₂, NO или CO (Igarashi et al., 2011). При этом у большинства бактерий белок Fur контролирует гены, ответственные за поглощение и деградацию гема. Благодаря высокому сродству к димеру Fur у E. coli молекула гема препятствует встраиванию в активный центр белка цинка или марганца (Smith et al., 1996). Другой тип взаимодействия с гемом, при котором белок Fur утрачивает сродство к ДНК, описан у цианобактерии Anabaena 7120 (Hernandez et al., 2004). В данном случае белок Fur содержит специфический цистеин-пролиновый участок, связывающий гем. Спектроскопический анализ подтвердил роль цистеина в качестве одного из аксиальных лигандов гема, а также редокс-чувствительного триггера (Pellicer et al., 2012). Таким образом, гем служит редокс-сигналом у Anabaena 7120. В настоящее время исследуется его способность посредством белков Fur регулировать анаэробное дыхание (Teixido et al., 2010; Yang et al., 2013).

Окислительный стресс – особая проблема фотосинтезирующих организмов, у которых железо-серные белки обоих фотосистем богаты лабильными кофакторами. У нитчатых азотофиксирующих цианобактерий эффективные пути передачи редокс-сигналов необходимы не только в вегетативных клетках, но и в гетероцистах, где активность нитрогеназы требует соблюдения анаэробных условий. Современные данные свидетельствуют о том, что существенную роль в редокс-гомеостазе нитчатой цианобактерии Anabaena 7120 играет белок FurA, у которого, помимо функции транскрипционного фактора, предполагается активность дисульфидредуктазы (Fillat, 2014). Такая ферментативная активность белка FurA, несвойственная его ортологам у гетеротрофных организмов, таких как L. monocytogenes и H. pylori, была подтверждена экспериментами in vitro (Botello-Morte et al., 2014). Как и другие представители своего семейства, белок FurA содержит два мотива CXXC, подобные которым имеются в составе тиолдисульфидоксидоредуктаз и тиоредоксин-подобных белков. Кроме того, остатки цистеина (С) в обоих участках белка FurA соседствуют с остатками лизина, стабилизирующими тиольные группы цистеина (Benoit, Auer, 2011). В отличие от своих известных ортологов, белок FurA не связывается с цинком, что, вероятно, обуславливает его способность реагировать на редокс-статус клетки (Botello-Morte et al., 2014). Данная способность белка FurA предполагает образование в его окисленном состоянии внутримолекулярной дисульфидной связи. Таким образом, ранее неизвестная редокс-активность белков семейства Fur еще больше расширяет современные представления о разнообразии их регуляторных функций.