1. Введение

Цианобактерии, представляющие главный источник фотосинтетической продукции в биосфере, нуждаются в ионах железа в качестве кофакторов фотосинтетической и дыхательной электрон-транспортных цепей, а также многих других клеточных функций. В связи с этим изучение генетической регуляции систем транспорта и гомеостаза железа у фотосинтезирующих организмов имеет большое фундаментальное и практическое значение. Широко известным модельным объектом молекулярной генетики фотосинтезирующих организмов является одноклеточная цианобактерия Synechocystis sp. PCC 6803 (далее Synechocystis 6803). Благодаря современным подходам биоинформатики и активному применению ДНК-микроэррей анализа, у Synechocystis 6803 выявлены гены предполагаемых систем транспорта железа (Katoh et al., 2001), в том числе гены, индуцируемые недостатком железа в среде (Houot et al., 2007). Однако функции многих из них не идентифицированы и их регуляция остается мало изученной. Известным глобальным регулятором гомеостаза железа у бактерий является ген fur, гомолог которого присутствует и у цианобактерий. Однако у цианобактерий этот ген является жизненно важным, вследствие чего выяснить его функцию с помощью инактивации до сих пор не удавалось. В нашей лаборатории сконструированы условные мутанты с инактивированным геном fur, которые в настоящее время служат объектом активных исследований. Вместе с тем важным является вопрос о регуляции самого гена fur, в чем может участвовать недавно обнаруженная антисмысловая РНК asFur.

Цель работы заключалась в изучении роли гена fur и гена его антисмысловой РНК в регуляции генов транспорта железа у цианобактерии Synechocystis sp. PCC 6803. В связи с этим были поставлены следующие задачи.

1. Сконструировать мутанты Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur для анализа функции этого гена.

2. Охарактеризовать мутант Synechocystis 6803 с дополнительной регулируемой копией гена asFur.

3. Изучить характер экспрессии ряда генов предполагаемого fur-регулона у мутантов с регулируемым геном fur и у мутантов с дополнительной регулируемой копией гена asFur.

2. Обзор литературы

Роль гена fur в гомеостазе железа и регуляции стрессового ответа у бактерий

Металлы служат необходимыми для клетки макро- и микроэлементами. К макроэлементам относятся натрий, калий, магний и кальций, к микроэлементам – часть переходных металлов, среди которых наиболее распространены железо, цинк, медь и марганец и реже встречаются кобальт, никель, молибден, хром и ванадий (Rosakis, 2004). Потребность в металлах широко варьирует у разных бактерий, однако их внутриклеточная концентрация строго контролируется на определенном уровне, поскольку как их недостаток (голодание), так и избыток (токсичный эффект) вреден для клетки. Железо, наряду с цинком и магнием, необходимо для всех микроорганизмов, за исключением некоторых молочнокислых бактерий и спирохет рода Borrelia (Posey, Gherardini, 2000). В основном железо присутствует в белках, содержащих гем и железосерные кластеры; при этом железосодержащие белки выполняют функции переносчиков электронов, катализаторов ферментативных реакций, а также регуляторов экспрессии генов, выступая в роли сенсоров внешних и внутренних условий клетки (Lill, 2009).

Многие микроэлементы, играющие важную роль в метаболизме бактерий, труднодоступны в природе. Например, недостаток железа является ограничивающим фактором первичной продуктивности океана (Coale et al., 1996), а его доступность в организме-хозяине (растении или животном) служит определяющим условием размножения патогенных бактерий (Nairz et al., 2010). Для выживания в условиях недостатка железа клетки развили ряд ответов, таких как уменьшение размера, сокращение числа вторичных метаболитов, синтез альтернативных белков (замещающих железосодержащие) и включение разнообразных механизмов эффективного поглощения железа из окружающей среды. Такие стратегии гомеостаза предполагают тонкую настройку экспрессии генов для физиологической адаптации клеток к изменяющейся концентрации металлов и предотвращения синтеза токсичных метаболитов. Железо, например, катализирует в реакции Фентона образование наиболее реакционноспособной и токсичной для клетки активной формы кислорода (АФК), гидроксильного радикала (Imlay, 2003). Физиолого-биохимические и генетические исследования доказывают прямую связь развития окислительного стресса с увеличением пула свободного внутриклеточного железа, как ординарным, так и вследствие нарушения гомеостаза этого металла (Touati, 2000; Latifi et al., 2005; Cornelis et al., 2011). В связи с этим у аэробных организмов имеет место координация гомеостаза железа и адаптивного ответа на окислительный стресс, и данную функцию у многих бактерий выполняет ген fur (ferric uptake regulator). То же название имеет суперсемейство родственных регуляторных белков, транскрипционных факторов, вовлеченных в регуляцию экспрессии генов гомеостаза металлов и стрессового ответа клетки (Табл. 1).

Таблица 1.

Типичные представители регуляторных белков суперсемейства FUR*

Белок	Основной адаптивный ответ	Металл-кофактор	Структурный металл
Fur	Гомеостаз металла	Fe2+	Zn2+
Zur		Zn2+	Zn2+
Nur		Ni2+	Zn2+
Mur		Mn2+	–
PerR	Окислительный стресс	Fe2+	Zn2+
Irr	Усвоение гема	Fe2+/гем	–

*Использованы данные из работы (Fillat, 2014)