ФОТОСИНТЕЗ

Под фотосинтезом понимают процесс, посредством которого растения на солнечном свету синтезируют органические соединения (в первую очередь углеводы) из не органических. Фотосинтез — единственный на Земле процесс, с помощью которого космическая энергия сол­нечного света трансформируется в энергию химических связей органических соедине­ний.

Проблема фотосинтеза представляет собой одну из наиболее важных и сложных проблем общей биологии. Фотосинтезу принадлежит центральная роль в общей энергетике растений и животных организмов, поскольку именно этот процесс служит первичным источником всей энергии, используемой живыми организмами в процессе жизнедеятельности.

Фотосинтез — один из наиболее мощных процессов преобразования солнечной энергии (т. е. энергии термоядерных процессов, протекающих на Солн­це), которая высвобождается в результате превращения водорода в гелий.

Солнечная энергия при участии зеленых растений и фотосинтезирующих бактерий преобразуется в свободную энергию органических соединений. Для осуществления этого уникального процесса в ходе эволюции был создан фо­тосинтетический аппарат, содержащий: 1) набор фотоактивных пигментов, способных поглощать электромагнитное излучение определенных областей спектра и запасать эту энергию в виде энергии электронного возбуждения, и 2) специальный аппарат преобразования энергии электронного возбуждения в разные формы химической энергии. Прежде всего это редокс-энергия, свя­занная с образованием высоковосстановленных соединений, энергия электрохимического потенциала, обусловленная образованием электрических и протонных градиентов на сопрягающей мембране, энергия фосфатных свя­зей АТФ и других макроэргических соединений, которая затем преобразуется в свободную энергию органических молекул.

Все эти виды химической энергии могут быть использованы в процессе жизнедеятельности для поглощения и трансмембранного переноса ионов и в большинстве реакций метаболизма, т. е. в конструктивном обмене.

Способность использовать солнечную энергию и вводить ее в биосферные процессы и определяет «космическую» роль зеленых растений, о которой так много и горячо говорил и писал великий русский физиолог К. А. Тимирязев.

Основные этапы исследования фотосинтеза

Фотосинтез как физиологический процесс был открыт в 1771 г. английским ученым Джозефом Пристли. Вся более чем 240-летняя история изучения фотосинтеза — это большая цепь научных исследований, в ходе которых были определены основные контуры этого сложнейшего процесса и изучены реакции, составля­ющие его физико-химическую основу. Можно выделить ряд периодов, кото­рые отражают главные ступени в познании механизма фотосинтеза.

Период 1771—1850 гг. включает работы Дж. Пристли, Я. Ингенхауза, Ж.Сенебье, Н.Соссюра, в которых были установлены основные закономерности газообмена, зависимость фотосинтеза от интенсивности света, концентрации углекислоты, содержания воды, т.е. был заложен фундамент учения о воздушном питании растений.

Период 1850—1900 гг. характеризуется работами в области энергетики фото­синтеза, утверждается понимание фотосинтеза как процесса фиксации солнеч­ной энергии. Основная идея была высказана Робертом Майером в 1842 г. и полу­чила дальнейшее развитие в работах по изучению роли в фотосинтезе отдельных участков спектра. Эта идея была экспериментально подтверждена опытами К.А.Тимирязева, в которых была установлена прямая связь между энергетической характеристикой отдельных лучей электромагнит­ного спектра, активностью поглощения их пигментами и интенсивностью фо­тосинтеза. В дальнейших работах этого периода была определена доля энергии, усваиваемая растениями в процессе фотосинтеза от всего количества падающей и поглощенной листом энергии (Ф.Н.Крашенинников, К.А.Пуриевич). В связи с общим интересом к процессам поглощения энергии про­водились глубокие исследования химии пигментов (М. Ненецкий, С. Цвет, А.Штоль, Г.Фишер).

Период 1900—1940 гг. — время расцвета физиологических исследований фо­тосинтеза. В эти годы впервые экспериментально обосновано представление о включении в фотосинтез двух различных по природе реакций — световых фото­химических и темновых энзиматических реакций, составляющих две основные стадии фотосинтеза и протекающих с разной скоростью: световая — 10^-5 с, темновая — 10² с (Ф.Блэкман, А.А.Рихтер, О.Варбур). Работы В.Н.Любименко по определению ассимиляционного числа (С0₂/Хл) и опыты Р.Эмерсона и А.Арнольда с прерывистым светом легли в основу современной концепции о «фотосинтетической единице» (ФСЕ) и двух фотосистемах. Изучение природы фотохимических реакций при­вело к утверждению фундаментального положения современного фотосинтеза о том, что кислород, образующийся в процессе фотосинтеза, освобождается в реакциях фотоокисления воды (К. Ван-Ниль, С.Рубен и М.Камен, Р.Хилл).

Период 1940—1950 гг. можно назвать временем расцвета биохимических ис­следований фотосинтеза. Изучение химизма темновых реакций в серии работ лаборатории М.Кальвина с использованием метода меченых атомов (¹⁴С) за­вершилось в 1956 г. открытием восстановительного пентозофосфатного цикла превращения углерода, известного в настоящее время как «цикл Кальвина». В этот период активно изучаются ферментные системы хлоропластов, выделя­ются различные коферменты и другие физиологически активные группы со­единений. В работах Р.Хилла, связанных с изучением геминовых соеди­нений, в хлоропластах были обнаружены цитохромы b₆ и f, что имело большое значение для современных представлений о функционировании цитохромного комплекса в ЭТЦ.

Период 1950—1960 гг. отмечен бурным развитием исследований различных сторон проблемы фотосинтеза. Работы Д. Арнона показали, что хлоропласт со­держит все каталитические системы, необходимые для транспорта электронов с выделением кислорода из воды, синтеза восстановленных соединений (НАДФН) и АТФ в процессе фотофосфорилирования, восстановления С0₂. В 1954 г. в лаборатории Д. Арнона было открыто циклическое, а в 1957 г. — нециклическое фотофосфорилирование и была сформулирована «теория элек­тронного потока». В этот период интенсивно развиваются фотохимические и физические исследования в области фотосинтеза.

Большое значение для дальнейшего развития исследований в области фотосинтеза имели проведенные в этот период работы Р.Эмерсона с сотр. по изучению спектра действия фотосинтеза. Были открыты два феноме­на: «эффект красного падения» — резкое снижение квантового выхода фото­синтеза при освещении хлоропластов дальним красным светом (680 — 700 нм) и «эффект усиления Эмерсона» — значительное усиление фотосинтеза при до­бавлении коротковолнового света (650 нм) к дальному красному. В 1961 г. ряд авторов сформулирова­ли представление о функционировании двух фотореакций в фотосинтезе (Р.Хилл, Ф.Бендалл), что легло в основу современной Z-схемы фото­синтеза. В рамках этих представлений в настоящее время проводятся детальные исследования физических, химических и функциональных особенностей фо­тосистемы I (ФС I) и фотосистемы II (ФС II), структурной организации их реакционных центров.

Современный период характеризуется комплексным подходом к изучению процесса фотосинтеза. Исследования на молекулярном уровне позволили вы­яснить основные принципы организации и функционирования фотосинтети­ческого аппарата, физический и биохимический механизмы его световых и темновых стадий. Получены новые данные о функциональной организации пигментов. Выделены и изучены светособирающие комплексы ФСI и ФС II, раскрыт принципиальный механизм распределения энергии между ними. Сфор­мулированы представления о функционировании ЭТЦ как взаимодействии трех функциональных комплексов — ФС I, ФС II, цитохром b₆/f-комплекса, изуче­ны механизмы их работы, структурная организация и локализация в мембра­нах стромальных и гранальных тилакоидов. Исследованы молекулярная орга­низация реакционных центров и механизмы преобразования энергии. Боль­шой прогресс в последние годы достигнут в исследовании фотоэнергетиче­ских реакций фотосинтеза. На основе хемиосмотической теории П.Митчелла (1961) и конформационной теории П. Бойера (1977) разработаны новые пред­ставления о молекулярной организации АТФ-синтазного комплекса и меха­низма синтеза АТФ в каталитических центрах АТФ-синтазы.

Таким образом, анализ истории более чем 240-летнего периода изучения фотосинтеза позволяет проследить логику развития научной мысли и установить главные направления в развитии научных идей, которые завершились в настоящее время построением достаточно стройной общей теории фотосинтеза.

Лист – специализированный орган фотосинтеза. Лист как орган растения, приспособленный к фотосинтезу, сформировался в результате длительного эволюционного процесса. Он представляет собой эффективную систему для поглощения и преобразования энергии света в ходе фотосинтеза. Структура листа обеспечивает наиболее полное поглощение квантов света, поступление углекислого газа из атмосферы к хлоропластам, а также возможность оттока ассимилятов из автотрофных клеток. Организация фотосинте­тического аппарата на уровне листа может быть охарактеризована на основе анализа его мезоструктуры. Основными показателями мезоструктуры листа являются: площадь листа, число клеток хлоренхимы на единицу площади листа, число хлоропластов в клетке и их объем, площадь поверхности хлоропластов, а также содержание хлорофилла в расчете на единицу площади листа, содержание ферментов уг­леродного цикла фотосинтеза в листе и их активность, общая интенсивность фотосинтеза. Показатели мезоструктуры листа могут значительно варьировать в зависимости от внешних факторов среды, а также от физиологического со­стояния растений.

Лист поглощает значительную часть излучения в видимой области спектра (400—700 нм). Бо'льшую часть синего и красного света поглощают пигменты хлоропластов первых слоев клеток хлоренхимы. Свет, не поглощенный в верхних слоях листа, обогащен лучами зеленой области спектра. Его многократное отражение от стенок мезофильных клеток в толще листа значительно увеличивает оптический путь и повышает вероятность поглощения лучей этой области спектра.

Структура листа обеспечивает по­ступление углекислого газа из воздуха для реакций фотосинтетической асси­миляции углерода. Газообмен мезофил­ла листа с окружающим воздухом осу­ществляется через устьица. Количество устьиц, их свойства (величина устьичной щели, устьичное сопротивление и др.) являются важными факторами регуляции фотосинтеза. Значительный объем подустьичного пространства, а также достаточно рыхлое расположение мезофильных клеток в листе и су­ществование больших межклетников в ткани хлоренхимы позволяют создать большие воздушные запасы в толще листа для непрерывного снабжения углекислым газом углеродных циклов фотосинтеза.

Лист — донор ассимилятов в рас­тении. Отток органических веществ, образовавшихся в процессе фотосинтеза, происходит по клеткам сосудистых пучков флоэмы. Транспорт ассимилятов из автотрофных клеток предполагает вынос сахарозы (основного транспортного соединения фотосинтеза) из автотрофной клетки и последующую загрузку флоэмы листа.

Хлоролпласты — центры фотосинтеза клеток растений. Фотосинтез в растительной клетке осуществляется специализированными органеллами — хлоропластами. От других типов пластид хлоропласты отлича­ются наличием зеленых пигментов хлорофиллов и сложно организованной системой внутренних мембран. Хлорофилл обеспечивает поглощение и пер­вичное преобразование энергии света при фотосинтезе, а высокая степень организации внутренних мембранных структур хлоропластов составляет физи­ческую основу для эффективного поглощения и преобразования энергии света в ходе фотосинтеза. Благодаря высокой степени организации внутренней мемб­ранной структуры хлоропластов достигаются условия, необходимые для преобразования энергии.

Основные элементы структурной организации хлоропластов у высших рас­тений представлены внешней оболочкой, стромой и хорошо развитой системой внутренних мембран.

Внешняя оболочка хлоропластов отграничивает его внутреннее содержимое от цитоплазмы. Это барьер, осуществляющий контроль обмена веществ между хлоропластом и цитоплазмой. Оболочка состоит из двух мембран — наружной и внутренней. Наружная мембрана проницаема для большинства органических и неорганических молекул. Вместе с тем она содержит специальные транслока­торы белков, через которые поступают пептиды из цитоплазмы в хлоропласт. Внутренняя мембрана оболочки хлоропластов обладает избирательной прони­цаемостью и осуществляет контроль над транспортом белков, липидов, органи­ческих кислот и углеводов между хлоропластом и цитоплазмой. Внутренняя мемб­рана оболочки участвует также в формировании внутренней мембранной си­стемы хлоропластов.

Строма — гидрофильный, слабоструктурированный матрикс хлоропластов, содержащий водорастворимые органические соединения, а также неорганические ионы. В строме располагаются ферменты углеродного цикла фото­синтеза, здесь осуществляются реакции фотосинтетической ассимиляции угле­рода. Кроме того, строма содержит ферменты синтеза фотосинтетических пиг­ментов, а также полярных липидов мембран хлоропластов. В строме находятся кольцевая ДНК (может быть несколько одинаковых копий), рибосомы, фер­менты матричного синтеза, обеспечивающие синтез белков, входящих в со­став мультипептидных комплексов мембран тилакоидов, а также водораство­римого белка — большой субъединицы рибулозобисфосфаткарбоксилазыоксигеназы — ключевого фермента углеродного цикла фотосинтеза.

Внутренняя мембранная система хлоропластов — здесь протекают световые реакции фотосинтеза. Она хорошо развита и неоднородна. На фотографиях зрелого хлоропласта видно, что внутренние мембраны (ламеллы), занимают 'большую часть общего объема хлоропластов. Мембраны образуют тилакоиды, которые либо тесно соприкасаются друг с другом и уложены в стопки, или граны (тилакоиды гран), либо пронизывают строму, соединяя гра­ны между собой (тилакоиды стромы). Соответственно образующие их мембра­ны называют мембранами (ламеллами) гран и мембранами (ламеллами) стромы. Пространство внутри тилакоидов называется внутритилакоидным пространством, или люменом.

Согласно современным представлениям, при образовании гран внут­ренняя мембранная система образует не замкнутые «мешочки», а, скорее, наслоения, склад­ки. В результате внутри хлоропласта возникает единая внутренняя мембрана, которая разделяет внутреннее пространство хлоропластов на два отсека (компартмента) — строму и люмен. Интеграция внутреннего пространства тила­коидов гран и стромы достигается за счет того, что тилакоиды гран пронизаны одной или несколькими тилакоидами стромы. Тилакоиды стромы могут быть сильно перфорированы, в результате чего образуются узкие или широкие мемб­ранные каналы, называемые фретами, которые связывают граны между собой.

Значение столь сложной организации внутренних мембран хлоропластов состоит в следующем.

1) Внутренние мембраны хлоропластов включают мультипептидные комп­лексы, обеспечивающие поглощение и преобразование энергии света в ходе световых реакций фотосинтеза. Благодаря значительному мембранному про­странству достигается увеличение числа функциональных единиц, способных осуще­ствлять световые реакции фотосинтеза.

2) Единство внутренней мембранной системы хлоропластов позволяет от­дельным компонентам мембраны мигрировать латерально и вступать между собой в структурный и функциональный контакт. Это необходимо для переноса энергии квантов света в реакционные центры, а также для транспорта электронов по электрон-транспортной цепи в ходе световых реакций фотосинтеза.

3) Разделение мембраной всего внутреннего пространства хлоропластов на два компартмента — стромальное и внутритилакоидное пространство (лю­мен) — позволяет создавать электрохимические градиенты ионов между ними. Создание электрохимического градиента Н⁺ на внутренних мембранах хлоропластов — важный этап в трансформации энергии квантов света в энергию макроэргических связей АТФ.

Образование гранальной структуры внутри хлоропластов значительно повы­шает общую эффективность фотосинтеза и создает дополнительные возможно­сти для регуляции световых реакций. Сегрегация (разделение) в отдельных отсе­ках мембраны (в стромальных или гранальных тилакоидах) компонентов мем­бран с различными функциями позволяет добиться определенной независи­мости их функционирования. Гранальная структура хлоропластов высших рас­тений — итог длительного эволюционного процесса.

Химический состав и физические свойства тилакоидных мембран. Общий принцип организации тилакоидных мембран хлоропластов подобен структуре любой другой мембраны клетки: основу мембраны составляет билипидный слой, в который погружены в большей или меньшей степени отдель­ные белки и белковые комплексы. Вместе с тем существует определенная спе­цифика липидного и белкового состава, а также особое распределение компонен­тов в мембранной системе хлоропластов. Это позволяет мембранам осуществ­лять уникальные энергопреобразующие реакции фотосинтеза и регулировать их в соответствии с меняющимися внешними условиями.

Внутренние мембраны хлоропластов включают липиды, белки и углеводы. Соотношение липидов и белков по весу близко к отношению 1 : 1. С учетом того, что молекулярная масса липидов мень­ше молекулярной массы белков, считают, что в среднем на 1 молекулу белка приходится около 500 молекул липидов. Углеводы главным образом входят в состав галактолипидов.

Белковые компоненты тилакоидных мембран. В мембранах хлоропластов на­считывают более 60 различных белков. Большая их часть — интегральные белки мультипептидных комплексов, осуществляющие процессы поглощения и транс­формации энергии при фотосинтезе. Другая часть белков располагается на по­верхности тилакоидных мембран либо со стороны стромы, либо со стороны люмена. Поверхностные белки входят в периферические домены мультипеп­тидных комплексов. Ряд поверхностных белков являются самостоятельными компонентами мембран.

Пять основных полипептидных комплексов встроены во внутренние мембраны хлоропластов: комплекс фотосистемы I (ФС I) , комплекс фотосистемы II (ФСII), светособирающий комплекс II (CCKII), цитохромный комплекс и АТФ-синтаза (CF₀— CF₁ -комплекс). Комплексы ФС I, ФСII и CCKII содержат пигменты (хлорофиллы, каротиноиды), большинство которых функциониру­ют как пигменты-антенны, собирающие энергию для пигментов реакционных центров ФС1 и ФСII. Комплексы ФС I и ФС II, а также цитохромный ком­плекс имеют в своем составе редокс-кофакторы и участвуют в фотосинтети­ческом транспорте электронов. Белки этих комплексов отличаются высоким содержанием гидрофобных аминокислот, что обеспечивает их встраивание в мембрану. АТФ-синтаза (CFo—CF1-комплекс) осуществляет синтез АТФ.

Кроме крупных полипептидных комплексов в мембранах тилакоидов имеются небольшие белковые компоненты — пластоцианин, ферредоксин и ферреционид.

Пигментные системы хлоропластов. Хлорофиллы. Главные функции хлорофиллов, представляющих собой магнийпорфирины, определены спецификой химического строения молекулы, ее физико-химическими свойствами, природой электронно-колебательных спектров. Функ­ции Мg-порфиринов формировались в процессе эволюции в тесной связи с эволюцией фоторецепторных структур. В основе молекулы Мg-порфирина ле­жит тетрапиррольная структура порфина, включающая 4 пиррольных кольца, соединенных метановыми мостиками. Пиррольное кольцо, состоя­щее из 4 атомов углерода и атома азота, является хромофором, способным поглощать энергию инфракрасной области спектра. Замыкание пиррольных колец в тетрапиррольную структуру порфина, образует химически более устойчивую молекулу хлорофиллов. Благодаря формированию циклической системы и эффекту сопря­жения двойных связей появляются интенсивные полосы поглощения в видимой области спек­тра с более высокой энергией квантов. Образующиеся в процессе эволюции порфирины представляют собой сложную систему с общим π-электронным облаком, объединяющим 4 пиррольных кольца в единый цикл. Из­вестно 10 различных структурных форм хлорофиллов (хлорофиллы а, b, с, d, е, бактериохлорофиллы а, Ь, с, d и протохлорофилл), несколько форм фикобили­нов, более 100 различных модификаций каротиноидов. Кроме того, одна и та же химическая структура в живом листе в комплексе с белками и липидами образует целую серию так называемых «нативных» форм. Так, для хлорофилла а известно около 10 таких спектрально различных форм. В итоге формируется мощная фоторецепторная система с боль­шим набором различных спектральных форм. Рассмотрим важнейшие из них.

Хлорофилл а (рис. ) — универсальный пигмент высших растений и водорослей. У не­которых водорослей (синезеленых, некоторых красных) он представляет един­ственную форму хлорофилла. Максимум поглощения в органических раство­рителях в красной области спектра находится при длинах волн 660 — 664 нм.

Хлорофилл в ( рис.) — дополнительный пигмент высших растений и водорослей, впервые появляется у эвгленовых водорослей, заменяя фикобилины. Отличается от хлорофилла а наличием альдегидной группы вместо метальной —СН₃ во II пиррольном кольце. Красный максимум поглощения в ацетоне 645 нм.

Хлорофилл с — дополнительный пигмент бурых и диатомовых водорослей. Молекула, не этерифицирована фитолом, связь 7=8 не гидрирована, остаток пропионовой кислоты при С₇ имеет двойную связь: —СН=СН—СООН.

Хлорофилл d — дополнительный пигмент красных водорослей, отличается от хлорофилла а наличием альдегидной группы при С₂ вместо —СН=СН₂. Красный максимум поглощения в органических растворителях 686 нм.

Бактериохлорофилл а (рис.) — главный пигмент у фотосинтезирующих бактерий.

В этиловом эфире максимумы погло­щения хлорофиллов группы а в красной части спектра — в пре­делах 660 - 663 нм, в синей - 428 - 430 нм, хлорофилла в - соответственно в пределах 642 — 644 и 452 — 455 нм.

Центральный атом магния определяет важнейшие физические и химические свой­ства молекулы магнийпорфирина. Включение магния в тетрапиррольную струк­туру значительно изменяет спектральные свойства хлорофилла. Магний и кетоэфирная группа в молекуле хлорофилла являются глав­ными компонентами для формирования димерных структур пигментов реак­ционного центра.

Фитол входит в состав хлорофиллов и представляет собой полиизопреноидную цепь, состоящую из 20 углеродных атомов (спирт фитол — С₂оН₃₉ОН), он является гидрофобным радикалом молекулы хлорофилла. Фитольная цепь не находится в электронном со­пряжении с макроциклом и поэтому практически не влияет на электронную структуру хлорофилла в возбужденных состояниях S₁ и S₂. В нативной системе взаимодействие фитола с гидрофобными белками позволяет регулировать положение макроцикла по отношению к свету и, таким образом, изменять активность светопоглощения

Рис. Структура хлорофилла а, b и бактериохлорофилла а

молекулой хлорофилла.

Запасание поглощенной энергии. Поглощение фотона (hv) обусловлено переходом фотосинтетической системы в различные энер­гетические состояния. В молекуле в отличие от атома возможны электронные, колебательные и вращательные движения, и общая энергия молекулы равна сумме этих видов энергий. Основной показатель энергии поглощающей систе­мы — уровень ее электронной энергии, определяется энергией внешних элек­тронов на орбите. Согласно принципу Паули, на внешней орбите находятся два электрона с противоположно направленными спинами, в результате чего образуется устойчивая система спаренных электронов. Поглощение энергии света сопровождается переходом одного из электронов на более высокую ор­биту с запасанием поглощенной энергии в виде энергии электронного воз­буждения. Важнейшая характеристика поглощающих систем — избирательность поглощения, определяемая электронной конфигурацией молекулы. В сложной органической молекуле есть определенный набор свободных орбит, на кото­рые возможен переход электрона при поглощении квантов света. Согласно «пра­вилу частот» Бора, частота поглощаемого или испускаемого излучения дол­жна строго соответствовать разности энергий между єнергетическими уровнями.

Каждый электронный переход соответствует определенной энергии поглощения. Запасание поглощенной энергии связано с возникновением электронновозбужденных состояний пигментов. Известно два основных типа воз­бужденных состояний — синглетные и триплетные. Они отличаются по энергии и состоянию спина электрона. В синглетном возбужденном состоянии спины электронов на основном и возбужденном уровнях остаются антипараллельными, при переходе в триплетное состояние происходит поворот спина возбужден­ного электрона с образованием системы с двумя одинаково направленными спинами. При поглощении фото­на молекула хлорофилла переходит из основного (S₀) в одно из возбужденных синглетных состояний — S₁ или S₂, что сопровождается переходом электрона на возбужденный уровень с более высокой энергией. Возбужденное состояние S₂ очень нестабильно. Электрон быстро (в течение 10̄¹² с) теряет часть энергии в виде тепла и опускается на нижний колебательный уровень где может находиться в течение 10^-9 с. В состоянии S₁ может произойти обращение спина электрона и переход в триплетное состояние Т₁ энергия которого ниже S₁. Возможно несколько путей дезактивации возбужденных состояний:

1) перенос энергии на другую молекулу;

2) превращение энергии возбуждения в тепло;

3) излучение фотона с переходом системы в основное состояние (флуоресценция или фосфоресценция);

4) использование энергии возбуждения в фотохимической реакции.

Миграция энергии между молекулами пигментов может осуществляться по следующим механизмам. Индуктивно-резонансный механизм (механизм Фёрстера) и обмен энергией осуществляется по экситонному механизму. Перенос энергии от возбужденной молекулы пигмента к другой молекуле осуществляется путем безызлучательного переноса энергии возбуж­дения. Электрон в возбужденном состоянии представляет собой осциллиру­ющий диполь. Образующееся при этом переменное электрическое поле может вызвать аналогичные колебания электрона в другой молекуле пигмента при выполнении условий индукции, определяющих достаточно силь­ное взаимодействие между молекулами (расстояние не более 10 нм).

Рис. Энергетические состояния молекулы хлорофилла. S0 — основное состояние; Sl, S2 — первое и второе синглетные возбужденные состояния; Т—триплетное возбужденное состояние

Возбужденная молекула хлорофилла возвра­щается в основное состояние различными путями (рис.). Отдав часть энергии в виде теплоты, молекула может излучить квант света с большей длиной волны (правило Стокса), что проявляется в виде флуоресценции. Как уже отмечалось, хлорофилл а поглощает свет в красной и синей областях спектра, но флуоресцирует лишь в красной. Время жизни синглетного возбужденного при этом состояния 10^-13 —10 ̄ ⁹ с.

Другой путь потери энергии состоит в переходе молекулы из синглетного возбужденного состояния в метастабильное триплетное (с обращением спина). Этот переход безызлучательный, т. е. энергия теряется в виде теплоты. Триплетное возбужденное состояние имеет гораздо большее время жизни (>10 ̄ ⁴ с). Из триплетного состояния молекула может вер­нуться в основное,

излучив еще более длинноволновый (чем в случае флуоресценции) квант света. Это обычно более слабое свечение и есть фосфоресценция.

Фикобилины. Фикобилины - фикоцианин, фикоэритрин и аллофикоцианин - входят в состав пигментных систем цианобактерий и красных водорослей, где вместе с хлоро­филлом а выполняют функции фоторецепторов в фотосинтезе. Фикобилины представляют группу тетрапиррольных пигментов с открытой цепью. Они не содержат металла, отдельные пиррольные кольца соединены метиновыми (—СН=) и метиленовыми (—СН₂—) мостиками и включают различные радикалы в форме метильных (—СН₃), винильных (—СН=СН₂), этильных (—СН₂—СН₃) групп, а также два остатка пропионовой кислоты (-СН₂-СН₂-СООН) (рис. ).

Фикоцианин (синего цвета) представляет со­бой комплекс фикоцианобилина (простетическая группа пигмента) с белком и является, таким образом, фикобилипротеидом с молекулярной массой 273 кДа.

Фикоэритрин (красного цвета) — комплекс фикоэритробилина с белком (молекулярная масса 226 кДа).

Аллофикоциаиин — синий пигмент с молекуляр­ной массой 134 кДа, состоящий из трех субъединиц. Простетическая группа пигментов при участии двух свободных карбоксиль­ных групп образует прочную ковалентную связь с белком, разрываемую толь­ко при нагревании с НСl. Пигментные комплексы водорастворимы и могут быть извлечены из клеток водорослей горячей водой.

Хромофорной группой фикобилинов является система сопряженных связей, которая образуется при участии атомов углерода и азота пиррольных колец и —СН-мостиков. В клетках водорослей фикобилины находятся в специальных гранулах — фикобилисомах, расположенных на поверхности мембран. Пигменты в грануле образуют последовательный ряд функционально связанных пигмент­ных комплексов. На поверхности фикобилисомы расположены коротковол­новые пигменты (фикоэритрин, 570 нм), ближе к мембране — пигменты с более длинноволновым максимумом (фикоцианин, 630 нм; аллофикоцианин, 650 нм ). Такое расположение пигментов в фикобилисоме позволяет с высокой скоростью и эффективностью осуществлять процессы миграции энергии, поглощаемой фикобилинами, на хлорофилл а, локализованный в мембране.

Максимумы поглощения света у фикобилинов находятся между двумя максимумами поглощения у хлорофилла: в оранжевой, желтой и зеленой частях спектра. 90 % энергии, поглощенной фикобилинами, мигрирует на хлорофилл а и ис­пользуется в фотохимических реакциях. Для понимания физиологической роли данной группы пигментов большое значение имеет явление хроматической адаптации, исследованное в работах Н.Гайдукова, А.Рихтера, Т.Энгельмана и др. Было установлено, что содержание и состояние пигментов у водо­рослей зависят от условий освещения. При изменении спектрального соста­ва света изменяется пигментный состав, увеличивается количество пигмен­тов, поглощающих измененный спектр света. Про­цесс хроматической адаптации позволяет водорослям оптимально использо­вать световую энергию, проникающую через толщу воды. Фикобилины функционируют как дополнительные пигменты в составе фо­тосистемы II. В процессе эволю­ции, начиная с эвгленовых водорослей, фикобилины как дополнительные пигменты были заменены на хлорофиллом b. Циклическая структура хлорофилла более устойчива по сравнению с открытой цепью фикобилинов, и дальней­ший путь эволюции фотоавтотрофных организмов происходил на основе циклических тетрапирролов.

Рис. Структура фикобилинов

Каротиноиды. Каротиноиды — большая и разнообразная группа желтых, оранжевых, крас­ных пигментов, поглощающих коротковолновую часть видимой области спект­ра (400—550 нм) и выполняющих ряд очень важных функции в фотосинтезе. По химической природе каротиноиды представляют собой полиизопреноидную цепь, состоящую из 40 атомов углерода, которая у большинства кароти­ноидов замыкается по концам в два иононовых кольца. Центральная часть мо­лекулы, состоящая из 18 атомов углерода, представляет собой систему сопря­женных связей, образуя основную хромофорную группу молекулы пигмента (рис. ).

В зависимости от содержания кислорода в молекуле каротиноида различают каротины (например, β-каротин), не содержащие кислорода, и

Рис. Наиболее часто встречающиеся каротиноиды

ксантофиллы — содержащие кислород в форме гидрокси-группы —ОН или эпокси-группы.

У высших растений главными представителями ксантофиллов являются лютеин, виолаксантин, зеаксантин и неоксантин. Каротиноиды присутствуют в мембранах у всех фотосинтезирующих организ­мов. Они выполняют ряд важнейших функций в процессе фотосинтеза — антенную (дополнительные пигменты в процессе поглощения солнечной энер­гии), защитную (тушители триплетного хлорофилла и синглетного кислорода) и фотопротекторную (предохраняют реакционный центр от мощных по­токов энергии при высоких интенсивностях света и стабилизируют липидную фазу тилакоидных мембран), защищая ее от переокисления.

Антенная функция предполагает энергетическое взаимодействие каротиноидов и хлорофиллов. Антенная функция имеет место в ССК. Возможность миграции энергии в пигментбелковом комплексе от возбужденных каротиноидов к хлорофиллу доказана экспериментально. Таким образом, главная функция каротино­идов в ССК — поглощение энергии и перенос ее на хлорофилл.

Каротиноиды характеризуются спектром поглощения в синезеленой области (400—550 нм). Хромофорная группа различных ка­ротиноидов может включать от 9 до 13 двойных связей, что определяет поло­жение максимумов, энергию возбуждения и общий вид спектра поглощения. У большинства каротиноидов спектр поглощения имеет главный максимум и два более или менее выраженных «плеча».

Каротиноиды в антенном комплексе и реакционном центре выполняют уникальную «защитную» функцию, и связана с тушением возбужденных триплетных состояний хлорофилла и синглетного кислорода (^*0₂). Механизм фотоповреждения фотосинте­тического аппарата в случае оксигенного фотосинтеза обусловлен фотоде­структивным действием активных форм кислорода, главным образом синглет­ного кислорода ^*0₂, образующегося при взаимодействии основной формы кислорода в атмосфере 0₂ с триплетно-возбужденным пигментом хлорофиллом. Образующийся синглетный кислород является сильным окислителем и вызывает фотоокисление окружающих структур. Особенно активно эти про­цессы протекают в реакционных центрах, где образование триплетного хлоро­филла (³Хл) происходит в результате возможного возврата богатого энергией электрона от первичного акцептора к пигментам реакционного центра. Каротиноиды, содержащие 9 и более двойных

связей, могут эффек­тивно тушить триплетное состояние хлорофилла и образовавшийся синглет­ный кислород. Механизм защитного действия β-каротина в реакционном цент­ре включает перенос энергии от ³Хл или *0₂ к β-каротину и превращение энер­гии образующегося триплетного каротина в тепло с переходом возбужденного каротина в состояние S₀.

Фотопротекторная функция каротиноидов. Фотопротекторная функция каротиноидов состоит в защите фотосинтети­ческого аппарата от излишка энергии возбуждения при высокой интенсивно­сти света. Эта функция связана с каротиноидами, образующими так называе­мый «ксантофилловый цикл». У высших растений и зеленых водорослей ксантофилловый цикл включает энзиматическое превращение виолаксантина в зеаксантин. Процесс катализируется ферментом деэпоксидазой, требует участия аскорбата и кислой среды (оптимум действия фермента при рН 5,0). Такие условия рН создаются в люмене при освещении хлоропластов. В темноте протекает обратная реакция превращения зеаксантина в виолаксантин, которая катализируется эпоксидазой.

Организация пигментов в хлоропластах, светособирающие комплексы. В настоящее время выделено 4 главных типа светособирающих (антенных) комплексов. Два из них, локализованные в ФСI и ФСII, связывают только молекулы хлорофилла а и β-каротин; два других — белки внешних светособирающих комплексов — связывают хлорофиллы а и b и каротиноиды. Фотосистема II включает центральный комплекс II (ядро комплекса), содержащий димер хлорофилла а П₆₈₀ и хлорофилл-содержащие белки — СР43 и СР47 (внутренние антенны). ФС II имеет также большой внешний антенный комплекс CCKII (LHC II), содержащий хлорофиллы а и b, каротиноиды. Фотосистема I включает центральный комплекс I (ядро комплекса), содержа­щий димер хлорофилла а (П₇₀₀), 2 молекулы β-каротина и около 100 молекул хлорофилла а, расположенных вокруг электрон-транспортной цепи и реакционного центра ФС I. Это внутренняя антенна. Внешний светособирающий комплекс CCKI (LHC I) содержит 80—120 молекул хлорофиллов а и b, каротиноиды и состо­ит из 4 субъединиц: Lhca 1, Lhca 2, Lhca 3 и Lhca 4 — с молекулярными массами 17 — 24 кДа.

Организация реакционных центров и фотосистем. Функциональная структура, обеспечивающая протекание первичных про­цессов фотосинтеза, известна как фотосинтетическая единица (ФСЕ). Она отражает взаимодействие двух пигмент-белковых комплексов — светособирающего (антен­ного) комплекса и реакционного центра. Понятие ФСЕ было предложено в 1936 г. X. Гаффроном и К. Волем. В последующие годы идея ФСЕ была развита в работах Л.Дюйзенса (1952) — «уницентральная модель» и в работах Р.Клей­тона (1965) — «мультицентральная модель».

Представление о ФСЕ — одно из фундаментальных положений современного фотосинтеза. В его основе лежат две идеи: 1) о групповом функциониро­вании пигментов (была сформулирована по итогам работ Р.Эмерсона и В.Ар­нольда 1943 г., установивших, что в выделении одной молекулы 0₂ участвует комплекс, содержащий 2400 молекул хлорофилла) и 2) о функциональной гетерогенности пигментов. В опытах В. Н.Любименко (1930) с определением ассимиляционного числа (С0₂/хлорофилл) показано, что не все молекулы хлорофил­ла фотохимически активны: 99 % всех пигментов находятся в антенных комп­лексах и выполняют функцию сборщиков энергии, и только около 1 % пиг­ментов, локализованных в реакционных центрах, непосредственно участвуют в процессах преобразования энергии. В результате формируется высокоэффек­тивная система поглощения и преобразования световой энергии в первичных процессах фотосинтеза. Вторым фактором, определяющим высокую кванто­вую эффективность первичных процессов фотосинтеза, является структурно-функциональная организация непосредственно самого реакционного центра..

Фотосистема II. ФС II организована на двух мембранных белках — D₁ и D₂. ФСII включает 4 молекулы хлорофилла а: две молекулы образуют димер с максимумом поглощения 680 нм (П₆₈₀), - реакционный центр, две дополнительные молеку­лы хлорофилла располагаются между П₆₈₀ и феофитином связаны с внутрен­ней антенной ФСII — СР43 и СР47, через которую энергия возбуждения по­ступает в реакционный центр. ФС II включает два хинона: Q_A и Q_B, а также две молекулы β-каротина (Кар) и цитохром Ь₅₅₉. Донором электронов для восстановления окисленного П₆₈₀ слу­жит тирозин Z (Tyr_z) остаток аминокислоты белка D1.

Рис. Структурно-функциональная организация комплекса ФС II

(Мn)₄ — Мn-содержащий кластер; Туr — тирозин-161 белка Д₁ — первичный донор электронов для П₆₈₀; цит. Ь₅₅₉ — цитохром Ь₅₅₉, Хл_z — сопровождающие хлорофиллы а; Кар — β-каротин; 0_А, 0_В — пластохиноны; D₁,D₂ — белки ядра реакционного центра. Пунктиром обозначен возможный циклический поток электронов

При возбуждении П₆₈₀ два электрона и энергия возбуждения передаются первичному акцептору электронов – феофетину. Окисленный П₆₈₀ становится способным окислять молекулу воды, забирать у нее 2 электрона. Оптимизацию работы системы окисления воды обеспечивают 3 гидрофиль­ных белка: 17, 23, и 33 кДа. Эта группа белков, называемых белками водо­окисляющего комплекса, она сопряжена с (Мп)₄-комплексом фотоокисления воды. Для работы комплекса необходимы кроме марганца ионы хлора и кальция.

Структурная модель фотосистемы I. Компоненты ЭТЦ ФСI расположены на трех белках: А, В и С. Состав редокс-кофакторов системы ФСI: П₇₀₀ — реакционный центр, первичный донор электронов; это димер хлорофилла а, (А₀) ; А₁ — вторичный акцептор - это витамин К (филлохинон), а также F_x, F_A, F_B — железосерные белки, содержат 4Fe-4S-кластеры.

Схема структурно-функциональной организации комплекса ФСI представлена на рис. Буквами обозначены отдельные пептиды. Эти редокс-центры образуют цепь, которая пересекает организованный в мембране комплекс ФСI от люменальной стороны к стромальной.

Рис. Структурно-функциональная организация комплекса ФСI.

Согласно новым данным, реакционный центр ФСI две симметричных ветви переноса элек­трона между П₇₀₀ и F_x: ветвь А и ветвь В. Обе ветви участвуют в переносе электрона от П₇₀₀ к F_x. Между П₇₀₀ и Ао в обеих ветвях обнаружены дополнительные моно­мерные молекулы хлорофилла а. Присутствие двух ветвей для на­чального разделения заряда должно удвоить скорость захвата энергии возбужде­ния и тем самым увеличить эффективность разделения зарядов в ФС I.

Цит. b₆/f комплекс. Имеются сведения о 10 субъединицах цит. b₆/f комплекса. Функциональный вклад главных субъединиц хорошо известен. Это железосерный белок Риске (FeS_R), содержащий [2Fe-2S] кластер, цит. f и цит. b₆.

Расположение субъединиц цит. b₆/f комплекса в мембране и относительно друг друга показано на рис. Белок цит. f прохо­дит сквозь мембрану, однако большая его часть располагается вне мембраны с люменальной стороны.

Протеин Риске - его значительная часть выступает в люмен, а участок, образуемый 25 аминокислотными остатками, следующими за N-терминальным

9

фрагментом, заякорен в мембрану.

Рис. Модель организации в мембране цитохром b6/f комплекса Цит. b6/f комплекс играет важную роль в схеме индукции протонного транспорта внутрь тилакоида. Считают, что образование восстановленных молекул пластохинона в форме радикала Q2 сопровождается захва­том двух протонов из внетилакоидного пространства, в результате чего

образуется молекула гидрохинона QH₂, которая путем латеральной миграции вдоль поверхности мембраны перемещается к цит. b₆/f комплексу. Перенос электронов с QH₂ на цитохромный комплекс сопровождается освобождением электронов внутрь тилакоида. Цит. b₆/f принимает также участие в циклическом электронном транспорте вокруг ФСI.

Свободными компонентами ЭТЦ являются пластохиноны (PQ) осуществляют транспорт электронов между комплек­сом ФС11 и цитохромным комплексом в составе пула пластохинонов. Другой свободный от участия в комплексах пластоцианин (Пц) — водорастворимый белок, содержащий один атом меди. Осуществляет перенос электронов по одноэлектронному типу, причем атом меди изменяет свою валентность (Си⁺ ↔ Си⁺²). Пц восстанавливает окисленный пигмент П₇₀₀ и окисляет цитохром b₆ цитохромного комплекса хлоропластов. К свободным переносчикам относится— ферредоксин (ФД) белок с [2Fe-2S] который осуществляет перенос электронов с ФСI на Фермент фер­редоксин-НАДФ-оксидоредуктаза (НАДФОР). Фермент НАДФОР содержит в качестве редокс-кофактора ФАД. Восстанавливает НАДФ⁺ в ФСI. Электроны для восстановления полу­чает от восстановленного ФД.

Эффэкт Эммерсона. Впервые идею о существовании в хлоропластах двух фотосистем высказал Р. Эмерсон (1957), изучая влияние света на квантовый выход фотосинтеза у хлореллы. Под квантовым выходом фотосинтеза понимается количество выделившегося 0₂ или связанного С0₂ на 1 квант

поглощенной энергии. Было показано, что квантовый выход высок при освещении хлореллы красными лучами с длиной волны 660 — 680 нм. Использование красного света с большей длиной волны приводило к снижению квантового выхода, а при 700 нм фотосинтез почти прекращался, хотя эта часть спектра еще поглощается хлорофиллом. Однако если хлореллу одновременно освещали коротковолновым (650 нм) и длинно­волновым (700 нм) красным светом, то суммарный эффект был выше, чем при действии каждого красного света в отдельности. Это явление получило название эффекта усиления Эмерсона. Отсюда возникло предположение, что в хлоропластах взаимодействуют две пигментные систе­мы.

Фотохимический механизм преобразования энергии. Все реакционные цент­ры имеют не только общий принцип организации, но и единый фотохимиче­ский механизм преобразования энергии. В реакционном центре происходит пер­вичное фотохимическое разделение зарядов между фотовозбужденным пиг­ментом реакционного центра и первичным акцептором. Поскольку ФС II взаимодействует с А в реакциях окислительно-восстановительного типа, структура, осуществляющая преобразование энергии, должна быть способна к обратимым окислительно-восстановительным реакциям. Как известно, молеку­ла хлорофилла способна к фотовосстановлению и фотоокислению. Исследова­ния с применением лазеров и высокоскоростной импульсной спектрофотометрии показали, что в реакционном центре реализуется фотоокислительный путь. Разделение зарядов в реакционном центре включает три стадии.

Первая стадия — первичное разделение зарядов. Высокоразрешающая техни­ка в фемтосекундном интервале (10 ̄ ¹⁵ с) позволила выделить два процесса на начальной стадии преобразования энергии — перенос энергии и перенос элек­тронов в реакционном центре: перенос энергии происходит быстрее, чем перенос элек­трона.

Вторая стадия — фотоокисление пигмента П₆₈₀. Разделение зарядов между возбужденным П₆₈₀ и первичным акцептором электрона феофетином осуществляется в течение нескольких пикосекунд. В результате образуется первичная радикальная пара (П680-Фео ̄ ). В течение следующих 200 пс происходит перенос электрона от Феофетина на Q_А с образованием вторичной радикальной пары (П₆₈₀-Фео) — восстановленного Q_А и окисленного П_680.

Третья стадия — восстановление пигмента. Окисленный пигмент П₆₈₀ имеет высокий окислительно-восстановительный потенциал (+1,12 В) и является очень активным окислителем, который может вызвать окислительную де­струкцию окружающих структур. Донором электрона для П₆₈₀ в нормальных физиологических условиях является тирозин Z, для которого источником электрона служит сложная система фотоокисления воды. В фотоокислении воды в восстановлении П₆₈₀ участвует тирозин D, цитохром в₅₅₉, Хл₀, β-каротин.

Z-схема фотосинтеза, нециклический, циклический, псевдоциклический транспорт электронов в хлоропластах.

Последовательность расположения редокс-агентов в ЭТЦ хлоропластов в соответствии с их окислительно-восстановительным потенциалом и данными по их локализации в комплексах отражает Z-схема фотосинтеза. Согласно Z-схеме, существует последовательный перенос электронов от ФСII к ФСI и две фотосистемы объединяются в единую цепь переноса электронов от воды к НАДФ⁺. Представление о существовании в хлоропластах двух фото­систем и их совместной последовательной работе впервые возникло в 1940-е годы, на основании опытов Р. Эмерсона. Было обнаружено эффект крас­ного падения квантового выхода фотосинтеза при освещении хлоропластов дальним красным светом 680 -700 нм. Если компоненты ЭТЦ на схеме транспорта электронов расположить не только в последовательности один за другим, согласно переносу электронов, но и по высоте – в зависимости от окислительно –восстановительного потенциала, то получится фигура в виде буквы Z. Отсюда и название – Z-схема. Позднее было показано, что в хлоропластах транспорт электро­нов возможен не только от воды к НАДФ⁺ с участием двух фотосистем, но и другие альтернативные пути с участием лишь одной из двух фотосистем. Кроме того, конечным акцептором электронов в ЭТЦ фотосинтеза вместо НАДФ⁺ может выступать молекулярный кислород. В настоящее время различают не­циклический, циклический и псевдоциклический транспорт электронов в хлоро­пластах.

Нециклический транспорт электронов — это перенос электронов от воды к НАДФ⁺, осуществляемый с участием двух фотосистем, цитохромного комплекса и промежуточных низкомолекулярных переносчиков — пула пластохинонов (PQ), пластоцианина (Пц), ферредоксина (ФД) и ферредоксин-НАДФ-оксидоредуктазы (НАДФОР). Он сопровождается выделением кислорода и восста­новлением НАДФ⁺. Сопряжен с синтезом АТФ (нециклическое фотофосфорилирование). Этот транспорт и отражает Z-схема.

Циклический транспорт с участием ФСI включает перенос электронов от восстановленного ферредоксина (ФД) обратно к окислен­ному П₇₀₀, при этом участвует пул пластохинонов, цитохромный комплекс и особый фермент ФД-хиноноксидоредуктаза (FQR). Циклический по­ток электронов с участием ФСI сопряжен с синтезом АТФ (циклическое фотофосфорилирование) и может обеспечивать дополнительный синтез АТФ, необходимый для процессов ассимиляции углерода. Он может быть альтерна­тивным путем использования энергии.

Циклический поток электронов в ФСII связан с обратным переносом электро­нов от восстановленных первичных хинонов Q_A и (или) Q_B к окисленному пиг­менту реакционного центра П₆₈₀. При этом участвуют цитохром Ь₅₅₉, β-каротин и сопровождающие молекулы хлорофилла a реакционного центра ФСII. Циклический поток электронов в ФСII является альтернативным путем использования энергии света. Он активируется в условиях, когда интенсив­ность света превышает возможности ЭТЦ утилизировать его энергию или при повреждении водоокисляюшей системы хлоропластов.

Псевдоциклический поток электронов — перенос электронов от воды на кислород — впервые был исследован А. Мелером и назван его именем — реакция Мелера. Восстановление кислорода может происходить как в ФСI, так и в ФСII. При этом поглощение кислорода может компенсировать его выделение в ходе фотоокисления Н₂0. В результате единственным продуктом этого процесса, как и в случае циклического потока электронов, будет АТФ, синтезируемая при псев­доциклическом фотофосфорилировании. Псевдоциклический поток электронов приводит к образованию активных форм кислорода (супероксид анион радикала O₂̄, перекиси водорода Н₂0₂), поэтому активация процесса может вызвать нарушения фотосинтетического аппарата. Этот альтернативный транспорт электронов активируется при высо­ких интенсивностях света в условиях дефицита в хлоропластах окисленного НАДФ⁺.

Фотофосфорилирование. Результатом переноса электронов по ЭТЦ является про­цесс трансформации энергии окисления гидрохинонов (QH₂) в электрическую энер­гию — электрохимический градиент ионов Н⁺ на мембране тилакоида. Протонный градиент дополняется работой ФСII по фотоокислению воды. Два протона при окислении молекулы воды освобождаются в полость тилакоидов. При синтезе НАДФН один протон поглощается из стромы, увеличивая разность концентраций протонов на мембране. Дальнейшие энергетические превращения на мембране тилакоида уже осуществляются АТФ-синтазным комплексом, в котором происходит трансформация градиента ионов Н⁺ в энергию макроэргической связи АТФ.

АТФ - синтетазный комплекс хлоропластов принадлежит семейству АТФаз F₁-типа, которые характерны также для бакте­рий и митохондрий. Комплекс продуцирует АТФ из АДФ и неорганического фосфата (Фн). Для этого исполь­зуется энергия трапсмембраниого протонного градиента, генерируемого при движении электронов по цепи электронного транспор­та за счет фотохимической трансформации световой энергии.

АТФ-синтазный комплекс состоит из двух частей: погру­женного в мембрану протонного канала CF₀ и энзиматического центра CF₁, выступающего над поверхностью мембраны в сторону стромы. На последнем расположены места связывания АДФ и Фн. CF₁ состоит из 5 видов субъединиц, α. β, γ, σ, ﻍ , которые являются поверхностными белками и прикрепляются к мембране со стороны стромы. Их стехиометрия 3:3:1:1:1. CF₀ включает 4 субъ­единицы, suI-IV, в предполагаемой стехиометрии 1:1:9:1.

Представления о структурной организации субъединиц АТФ- синтазного комплекса в мембране были сформированы благодаря недавним успехам в применении методов ядерного магнитного резонанса и ренгено-структурного анализа. Активный фермент CF₁ представлен в мембране в виде ансамбля статических частей и под­вижных, вращающихся, субъединиц. Статическая часть состоит из субъединиц I, II, IV CF₀ и α. β, ∆ CF1. К подвижной части относятся субъ­единицы CF₁ γ и ﻍ, также 9 копий субъединицы III CF₀.

Рис. Модель организации в мембране АТФ-синтетазного комплекса

Структура головки фермента установлена на основании данных, полученных при изучении бактериального и митохондриального комплексов. Головка представлена гексомерным кольцом из перемежающихся α и β –субъединиц. Таким образом, формируются три группы α. β, -гетеродимеров, которые могут принимать три нуклеотид-связывающие конформации: незаполненный, пустой сайт, АДФ/Фн и АТФ прочно связывающие сайты. Эти структур­ные особенности обеспечивают реализацию вращательного меха­низма, согласно которому центральная γ - субъединица осуществляет вращение в пределах α. β, гексамера, проводя фермент через три последовательные конфигурации, необходимые для синтеза/гидролиза АТФ. Часть γ- субъединицы взаимодействует с CF₀, являясь ножкой CF₁. Выступающая часть γ-субъединицы вращается благодаря выходу протонов из люмена в строму через канал, образуемый субъединицами III CF₀.

Хемиосмотический механизм синтеза АТФ. Механизм фосфорилирования AДФ, сопряженный с работой электрон-транспортной цепи на сопрягающих мембранах, объясняет хемиосмотическая теории, разработанная в 1961-1966 гг. применительно к митохондриям английским биохимиком, Нобелевским лауреатом 1978 г. Питером Мит­челлом. Он ввел понятие сопрягающие мембраны, т. е. мембраны, на которой процесс транспорта протонов сопряжен с процессом синтеза АТР. Такие мембраны, по его мнению, должны быть непроницаемы для протонов и иметь электрон-транспортную цепь, в ко­торой переносчики электронов и протонов чередуются с переносчиками только электро­нов. Сущность теории Митчелла можно свести к двум положениям: во-первых, элек­трон-транспортная цепь функционирует таким образом, что на мембране возникает электрохимический градиент ионов Н⁺, а во-вторых, обратный ток ионов Н⁺ через протонный канал сопровождается образованием энергии фосфатной связи АТФ. Первоначально его теория объясняла механизм синтеза АТФ в митохондриях.

В 1967 г. А. Ягендорф использовал теорию Митчелла для объяснения процессов фотофосфорилирования на тилакоидной мембране. Изолированные из хлоропластов граны с рН 8 помещали в буферный раствор с рН 4. После инкубации рН в гранах выравнивался до 4. Затем граны с рН 4 переносились в буферный раствор с рН 8. Таким образом, на тилакоидных мембранах искусственно задавался градиент протонов, который обычно формируется при фотохимических процессах (внутри тилакоида —рН 4, а снаружи — рН 8). В этих условиях после добавления в среду AДФ и Ф_н в темноте синтезировалась АТФ. Эти эксперименты являются хорошим подтверждением применимости хемиосмотической теории Митчелла для объяснения процессов, происходящих при фотофосфорилировании в хлоропластах.

Сам процесс синтеза АТФ обясняет обменно-связывающий механизм синтеза АТФ Бойера, который включает три принципиальных положения.

1) Основным этапом, требующим энергии, является не синтез АТФ из АДФ и Ф_н, а процесс отделения АТФ от фермента.

2) В АТФ-синтазном комплексе связывание субстратов и высвобождение продуктов реакции происходит в трех отдельных, но взаимодействующих между собой катали­тических участках фермента. При этом каждый каталитический участок может суще­ствовать только в одном из трех конформационных состояний.

3) Поток ионов Н⁺ через протонный канал СF_о по градиенту электрохимического потенциала вызывает вращение γ-субъединицы АТФ-синтазного комплекса. Это вра­щение приводит к конформационным изменениям в каталитических участках, которые позволяют АТФ высвобождаться от фермента и процессу идти дальше.

Доказательство вращательного механизма синтеза АТФ. Два первых постулата Бойера получили много подтверждений, основанных главным образом на анализе кинетики процесса, и являются общепринятыми. Утверждение же о вращательном механизме процесса сопряжения между потоком Н⁺ и синтезом АТФ доказать было сложнее. Это удалось сделать группе английских исследователей в ла­боратории Д. Уокера в Кембридже. Они провели высоко - разрешающий кристаллографический анализ структуры СF₁-комплекса АТФ-азы митохондрий быка. Выло выявлено, что в каталитический комплекс входят три β- и три α-субъединицы, которые расположены, чередуясь подобно долькам апель­сина. Три α/β гетеродимера отличаются друт от друга и конформационно, и по связанным с ними нуклеотидам, что подтверждает наличие механизма синтеза АТФ по принципу связывание-обмен. При этом γ - субъединица, как стержень, вставлена внутрь каталитического комплекса. Между α и β-субъединицами обнаружены высокогидро­фобные взаимодействия, что обеспечивает возможность вращения γ-субъединицы внут­ри полости, образуемой в каталитическом центре фермента. После анализа кристаллической структуры СF₁ АТФ-синтетазы были сняты практически все вопросы, касающиеся механизма синтеза АТФ. Однако окончательное доказательство вращения γ-субъединицы в каталитическом центре можно было получить, если бы его удалось зафиксировать визуально. Такой эксперимент удалось провести Масасуке Ешида с коллегами в токийском технологическом институте Японии. Они пометили флуорисцирующим зондом актиновый филамент и «пришили» его к γ -субъединице СF_1. (рис.).

Рис. Метод, который позволил зарегистрировать вращение γ-субъединицы

Затем СF₁ комплекс был прикреплен к стеклянной поверхности. Если γ -субъединица вращается, то должен вращаться и актиновый филамент. Что должно быть видно во флуоресцентный микроскоп. И действительно, как только к модифицированному комплексу СF₁ добавили АТФ актиновый филамент начинал вращаться.

Согласно современной модели функционирования АТФ-синтетазного комплекса хлоропластов источником энергии для мембранного транспорта протонов является градиент протонов на мембране тилакоидов. Движение протонов по каналу АТФ-синтетазы вызывает вращение субъединиц III внутри мембраны. Это инициирует вращение γ -субъединицы, связанной с комплексом СF₀. Вращение γ-субъединицы внутри СF₁-комплекса вызывает конформационные измене­ния в каталитическом центре, необходимые для синтеза АТФ. Предполагается, что каталитический комплекс сам по себе не вращается и крепится к мембране с помощью I и II субъединиц. В терминах электротехники F₁-комплекс и мембранный «якорь» (субъединицы I и II) сравнивают со статором, в то время как γ -субъединицу и вра­щающуюся часть комплекса — с ротором. За свой вклад в установление механизма синтеза АТФ П.Бойер и Д. Уокер в 1997 г. получили Нобелевскую премию.

Путь углерода в фотосинтезе (темновоя фаза фотосинтеза)

В результате фотохимических реакций в хлоропластах создается необходимый уровень АТФ и НАДФH. Эти конечные продукты световой фазы фотосинтеза стоят на входе в темновую фазу, где С0₂ восстанавливается до углевода.

Однако сами по себе АТФ и НАДФH не в состоянии восстановить С0₂. Очевидно, и темновая фаза фотосинтеза — сложный процесс, включающий большое количество реакций. Кроме того, существуют различные пути восстановления СО₂,. В настоящее время известны так называемые С₃-путь и С₄-путь фиксации С0₂, фотосинтез по типу толстянковых (САМ-метаболизм) и фотодыхание. Рассмотрим каждый из этих путей в отдельности.

С₃-путь ассимиляции С0₂, присущий всем растениям, в 1946—1956 гг. был расшифрован американским биохимиком М. Кальвином и его сотрудниками. Прежде всего, была поставлена задача обнаружить первичный продукт фотосинтеза и выяснить, какое соединение служит акцептором С0₂.

Для решения первого вопроса были использованы одно­клеточные зеленые водоросли (хлорелла и др.) и меченый ¹⁴С0₂. Фотосинтезирующие водоросли помешали в среду, со­держащую ¹⁴С0₂, на разные промежутки времени, затем клетки быстро фиксировали, экстрагировали из них спирторастворимые вещества и определяли содержание ¹⁴С в различных соединениях после их разделения с помощью хроматографии. Оказалось, что после экспозиции в течение I мин ¹⁴С вклю­чался в С₃ —С₇-сахара и фосфосахара, в органические кислоты (яблочную, щавелевоуксусную, ФЕП), в аминокислоты (аланин, аспарагиновую кислоту). Если же время экспозиции было сокращено до 0,1—2 с, то большая часть метки обнару­живалась в фосфоглицериновой кислоте, в ее карбоксильной группе. Следовательно, фосфоглицериновая кислота (ФГК) является первичным продуктом фотосинтеза.

Второй вопрос — природа первичного акцептора С0₂. Сначала предположили, что таким акцептором является какое-либо двухуглеродное соединение. Однако введение в инку­бационную среду винилфосфата, фосфогликольальдегида и дру­гих веществ с С₂ не приводило к увеличению содержания радиоактивной метки из С0₂ в ФГК. Тогда схему опыта видоизменили следующим образом. Водоросли экспонировали на свету при высокой (1 %-ной) концентрации С0₂, затем резко снижали его концентрацию до 0,003%. Расчет был на то, что в условиях дефицита С0₂ быстро накопится именно то соединение, которое служит акцептором С0₂. С помощью двумерной хроматографии удалось установить, что при отсут­ствии возможности карбоксилирования в клетках кратко­временно возрастает концентрация рибулозо-1,5-дифосфата (рибулозо-1,5-бисфосфата). Отсюда возникло предположение, что первичная фиксация С0₂ происходит следующим образом: С₅ + С0₂→ С₆→ 2С₃.

Эта реакция катализируется рибулозодифосфаткарбоксилазой (рибулозобисфосфаткарбоксилазой; другие названия — белок фракции I,

Рис. Сз-путь фотосинтеза (цикл Кальвина).

Ферменты: 1 — рибулозо-5-фосфаткиназа; 2 — рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигепаза (РУБИСКО); 3 — фосфоглицераткиназа; 4 —глицеральдегид-З-фосфатдегидрогепаза; 5 — триозофосфатизомераза; 6 — альдолаза; 7 — фруктозо-1,6-бисфосфатфосфатаза; 8 — транскетолаза; 9 — альдолаза; 10 — седогептулозо-1,7-бисфосфатфосфатаза; 11 — транскетолаза; 12 — рибозо-5-фосфатизомераза; 13 — рибулозо-5-фосфатэпимераза.

карбоксидисмутаза). Максимум активности фермент имеет при рН 7,8-8,0 и нуждается в присутствии ионов Mg^{2 +} .

Дальнейшая работа в лаборатории Кальвина и в других лабораториях привела к расшифровке всех последующих реакций С₃-пути фотосинтеза, который получил название цикла Кальвина (рис. ). Этот цикл, весьма напоминающий обращенный пентозофосфатный путь дыхания, состоит из трех этапов: карбоксилирования, восстановления и регене­рации.

1) Карбоксилирование. Молекулы рибулозо-5-фосфата фосфорилируются с участием АТФ и фосфорибулозокиназы, в результате чего образуются молекулы рибулозо-1,5-дифосфата, к которым в свою очередь присоединяется С0₂ с помощью рибулозодифосфаткарбоксилазы. Полученный продукт расщепляется на две триозы: 2 молекулы 3-фосфоглицериновой кислоты (3-ФГК).

2) Фаза восстановления. 3-ФГК восстанавливается до 3-фосфоглицеринового альдегида (3-ФГА) в два этапа. Сначала происходит фосфорилирование 3-ФГК при участии АТФ и фосфоглицераткиназы до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты, а затем восстановление 1,3-ФГК с помощью НАДФH и дегидрогеназы фосфоглицеринового альдегида.

3) Фаза регенерации первичного акцептора диоксида углерода и синтеза конечного продукта фотосинтеза. В резуль­тате описанных выше реакций при фиксации трех молекул С₆ и образовании шести молекул восстановленных 3-фосфотриоз пять из них используются затем для регенерации рибулозо-5-фосфата, а один — для синтеза глюкозы. 3-ФГА под дейст­вием триозофосфатизомеразы изомеризуется в фосфодиоксиацетон. ФГА и фосфодиоксиацетон конденсируются с образованием фруктозо-1,6-дифосфата, у кото­рого отщепляется один фосфат с помощью фруктозо-1,6-дифосфатазы. В дальнейших реакциях, связанных с регенера­цией первичного акцептора С0₂, последовательно принимают участие транскетолаза и альдолаза. Транскетолаза катали­зирует перенос содержащего два углерода гликолевого альде­гида от кетозы на, альдозу. Альдолаза затем осуществляет перенос трехуглеродного остатка фосфодиоксиацетона на альдозу, в данном случае на эритрозо-4-фосфат, в результате чего синтезируется седогептулозо-1,7-дифосфат. Последний дефосфорилируется и под действием транскетолазы из него и 3-ФГА образуются ксилулозо-5-фосфат и рибозо-5-фосфат. Две молекулы ксилулозо-5-фосфата при участии рибулозофосфатэпимеразы и одна молекула рибозо-5-фосфата с участием рибозофосфатизомеразы превращаются в три молекулы рибулозо-5-фосфата, с которого начинается новый цикл фиксации С0₂.

Из оставшейся неиспользованной 6-й молекулы 3-ФГА под действием альдолазы синтезируется (при повторении цикла) молекула фруктозо-1,6-дифосфата, из которой могут образо­вываться глюкоза, сахароза или крахмал.

Таким образом, для синтеза одной молекулы глюкозы в цикле Кальвина необходимы 12 НАДФН и 18 АТФ (рис. ), которые поставляются в результате фотохимических реакций фотосинтеза.

С₄ путь фиксации СО₂. В работах А. Незговоровой (1956-1957 гг.), было установлено, что при коротких экспозициях листьев кукурузы на свету ¹⁴С из ¹⁴С0₂ обнаруживается в аспарагиновой кислоте. В дальнейших исследованиях эти представления были развиты, что привело к открытию С_л-пути углерода в фотосинтезе. Как новый тип фиксации С0₂, принципиально отличающийся от цикла Кальвина, этот цикл впервые описали австралийские ученые М. Д. Хетч и К. Р. Слэк (1966). К группе растений с С₄-путем фотосинтеза относятся сахарный тростник, кукуруза, сорго и др. Листья этих растений содержат два разных типа хлоропластов: хлоропласты обычного вида — в клетках мезофилла и большое количество крупных хлоропластов, часто не имеющих гран, — в клетках, окружающих проводящие пучки (обкладка). С0₂, диффундирующий в лист через устьица, попадает в цитоплазму клеток мезофилла, где при участии ФЕП-карбоксилазы вступает в реакцию с ФЕП, образуя щавелевоуксусную кислоту (оксалоацетат). Затем уже в хлоропластах оксалоацетат восстанавливается до яблочной кислоты (малата) за счет НАДФН, образующего в ходе световой фазы фотосинтеза (рис.).

Рис. С₄-путь фиксации СО₂. Ферменты: 1 — ФЕП-карбоксилаза; 2 — малатдегидрогеназа; 4 — маликєнзим; 7 — пируватортофосфатдикиназа.

Щавелевоуксусная кислота в присут­ствии NH₄ может превращаться также в аспартат. Затем малат (или аспартат) переносится в хлоропласты клетки обкладки сосудистого пучка, где он декарбоксилируется малик-энзимом (малатдегидрогеназой декарбоксилируюшей) до пирувата и С0₂.

Как уже отмечалось, в хлоропластах обкладки отсутствуют граны, а следовательно, слабо представлена ФС II, необходимая для нециклического транспорта электронов, однако в них в изобилии накапливается крахмал. Объясняется это тем, что в хлоропластах обкладки используется поставляемый маликэнзимом НАДФН, а также тот С0₂, который образовался при окислительном декарбоксилировании малата (или аспартата). В этих хлоропластах в процессе циклического фото­фосфорилирования синтезируется большое количество АТФ и фиксация С0₂ осуществляется по типу цикла Кальвина. У некоторых растений с С₄-путем фотосинтеза (амарант, лебеда) яблочная кислота декарбоксилируется в митохондриях клеток обкладки с образованием НАДН.

Возникающий при расщеплении малата в хлоропластах клеток обкладки пируват перемещается назад в хлоропласты клеток мезофилла (рис.), где может снова превращаться в первичный акцептор С0₂ — ФЕП. Такая компартментация процессов позволяет растениям с С₄-путем осуществлять фотосинтез даже при закрытых устьицах, так как хлоропласты клеток обкладки используют малат (аспартат), образовавшийся ранее, как донор С0₂. С₄-растения могут также исполь­зовать С0₂, возникающий при фотодыхании (см. дальше). Закрывание устьичных отверстий в наиболее жаркое время дня сокращает потери воды за счет испарения (транспирации). Не удивительно поэтому, что к С₄-растениям относятся многие виды засушливой тропической зоны. Растения с С₄-путем фотосинтеза, как правило, устойчивы к засолению. Эффективность использования воды, т. е. отношение массы ассимилированного С0₂ к массе воды, израсходованной при транспирации, у С₄-растений зачастую вдвое выше, чем у С₃-растений. Таким образом, С₄-растения имеют преиму­щества перед С₃-растениями в засушливых местах обитания благодаря высокой интенсивности фотосинтеза даже при закрытых устьицах. Фиксация С0₂ с участием ФЕП и образова­ние малата (аспартата) служит как бы насосом для поставки С0₂ в хлоропласты обкладки, функционирующие по С₃-пути.

Фотосинтез по типу Толстянковых. Суккуленты (роды Crassula, Bryophyllum и др.) при­способились осуществлять фотосинтез в условиях резко засуш­ливого климата. Для них характерен суточный цикл мета­болизма С₄-кислот с образованием яблочной кислоты ночью. В соответствии с английским выражением crassulacean acid metabolism (САМ) этот тип фотосинтеза часто сокращенно называют САМ-метаболизм. Устьица этих растений днем обыч­но закрыты, что предотвращает потерю воды, и откры­ваются ночью. С0₂ поступает в листья, где при участии содержащейся в цитоплазме ФЕП-карбоксилазы взаимодей­ствует с фосфоенолпируватом, образуя оксалоацетат. Источни­ком ФЕП служит крахмал. То же самое происходит и с С0₂, который освобождается в клетках в процессе дыхания. Образовавшийся оксалоацетат восстанавливается под действием NADH-зависимой малатдегидрогеназы до яблочной кислоты, которая накапливается в вакуолях клеток листа (рис.). Это приводит к закислению клеточного сока в ночное время. Как и у С₄-растений, оксалоацетат может быть источником аспартата, однако этот путь здесь менее выражен.

Днем в условиях высокой температуры, когда устьица закрыты, малат

Рис. Метаболизм кислот по типу толстянковых. Ферменты: 1 —ФЭП-карбоксилаза; 2 — NADP-малатдегидрогеназа; 3 — NADP-маликэпзим.

транспортируется из вакуолей в цитоплазму и там декарбоксилируется при участии малатдегидрогеназы декарбоксилирующей (малик-энзима) с образованием С0₂ и пирувата. С0₂ поступает в хлоропласты и включается в них в цикл Кальвина, участвуя в синтезе Сахаров.

Таким образом, у растений с фотосинтезом по типу толстянковых много общего с С₄-путем фотосинтеза. Однако при САМ-мстаболизме фиксация С0₂ с образованием малата (ночью) и декарбоксилироваиие малата с высвобождением СО, и пирувата (днем) разделены во времени. У С₄-расгений эти же реакции разграничены в пространстве: первая протекает в хлоропластах мезофилла, вторая - в клетках обкладки. При достаточном количестве воды ряд растений с метаболизмом по типу толстянковых могут вести себя как С₃-растсния. В свою очередь некоторые растения с С₃-путем фото­синтеза при недостатке воды проявляют черты САМ-метаболизма.

Фотодыхание. В растительных клетках, содержащих хлоропласты, помимо С₃- и С₄-путей фотосинтеза, осуществляется также фотодыхание, т. е. активируемый светом процесс высвобождения СО₂, и поглощения О₂, который значительно отличается от «темнового» дыхания митохондрий. Так как при этом пер­вичным продуктом является гликолевая кислота, то этот путь получил название гликолатного. У некоторых С₃-растений с малой эффективностью фотосинтеза интенсивность фотодыха­ния может достигать 50% от интенсивности фотосинтеза. То есть половина фиксированного на свету в процессе фотосинтеза углерода снова выбрасывается в виде С0₂.

Фотодыхание у C₃-растений обычно усиливается при низком содержании С0₂ и высоких концентрациях 0₂. В этих условиях РДФ-карбоксилаза в хлоропластах может функциони­ровать как оксигеназа, катализируя окислительное расщепление рибулозо-1,5-дифосфата на 3-ФГК и 2-фосфогликолевую кисло­ту, которая затем дефосфорилируется в гликолевую кислоту (рис.). Молекулы С0₂ и 0₂ конкурируют между собой в каталитическом центре РДФ-карбоксилазы: при относитель­но высоких концентрациях С0₂ и низких 0₂ преобладает карбоксилирование, тогда как высокие концентрации 0₂ и низкое содержание СО₂, благоприятствуют окислению РДФ, а, следовательно, и образованию фосфогликолевой кислоты. В том же направлении действует и повышение температуры. Фотодыхание осуществляется в результате взаимодействия трех органелл — хлоропластов, пероксисом и митохондрий (рис.). Гликолат из хлоропласта поступает в пероксисому и там окисляется гликолатоксидазой до глиоксилата. Воз­никающая перекись водорода устраняется каталазой пероксисомы. Глиоксилат аминируется, превращаясь в глицин, причем в качестве донора аминогруппы функционирует глутамат.

Глицин транспортируется в митохондрию. Здесь из двух молекул глицина образуется серии и освобождается С0₂. Теперь цикл замыкается: серин может снова поступать в пероксисому и там передать свою аминогруппу на пируват. При этом из пирувата возникает аланин, из серина — гидроксипируват, который сразу после этого восстанавливается в глицерат. Затем глицерат может снова попасть в хлоропласты и благодаря фосфорилированию включиться в цикл Кальвина. Последовательность реакций фотодыхания не обязательно образует цикл. Гликолатный путь С₃-растений может завер­шиться в митохондриях.

Конечными продуктами в этом случае являются серин и С0₂. Освобождение С0₂ в процессе фотодыхания объясняет, почему нетто-фотосинтез (чистая продуктивность) при интенсивном фотодыхании снижается (рис.).

У С₄-расгений С0₂, выделяющийся в результате фото­дыхания, перехватывается в клетках мезофилла, где из ФЕП и С0₂ образуются оксалоацетат и малат. Затем малат «отдает» свой С0₂ хлоропластам обкладки, где функциони­рует цикл Кальвина. В связи с этим становится понятным высокий нетто-фотосинтез С₄-растений.

Однако для чего же тогда нужно фотодыхание? Необходимо вспомнить, что гликолатный путь приводит к синтезу глицина и серина. В пероксисомах происходит восстановление НАДФ⁺; имеются косвенные данные о том, что в процессе образо­вания серина может генерироваться и АТФ. Показано, что С₃-растения, помещенные в атмосферу с низким парциальным давлением 0₂ и высокой концентрацией С0₂, ведут себя подобно С₄-растениям, т. е. имеют низкий уровень фото­дыхания. Фотодыхание может играть регуляторную роль в процессе фиксации С0₂, быть как-бы «страховочным клапаном», выпускающим избыток фиксированного С0₂, который клетка не может переработать.

Из всего сказанного можно сделать вывод, что термин фотодыхание имеет

Рис. Фотодыхание: последовательность превращений гликолата (объяснение в тексте)

лишь формальный смысл: 0₂ потреб­ляется, С0₂ выделяется, однако в функциональном плане к дыханию этот процесс прямого отношения не имеет.

Транспорт ассимилятов

Внутриклеточный транспорт веществ. Уже в первые секунды фотосинтеза происходит выход ассимилятов в цитоплазму. После кратковременного фото­синтеза с ¹⁴С0₂ в цитоплазме прежде всего появляются меченые фосфотриозы — ФГК и ФДА, а затем [¹⁴С] фруктозо- 1,6-дифосфат.

Выход предшественников углеводов из хлоропластов в ци­топлазму совершается в виде ФГК, ФГА и ФДА.

Выходящие из хлоропластов ассимиляты могут использо­ваться в самой фотосинтезирующей клетке двумя путями: 1) в окислительно-восстановительных процессах, что обычно заканчивается освобождением С0₂, 2) для увеличения массы клетки в процессе ее роста и отложения запасных и вторич­ных веществ. Большая часть ассимилятов транспортируется из фотосинтезирующих клеток листа в другие органы и ткани.

Так как оболочка хлоропласта лишь в слабой степени проницаема для АТФ и НАДФН, перенос из хлоропластов в цитоплазму высоко­энергетических и восстановительных эквивалентов осуществляется с по­мощью челночного механизма в результате реакций восстановления-окисления между ФГК и ФДА, так как скорость выхода триозофосфатов через мембраны оболочки хлоропласта приближается к скорости свободной диффузии (рис.).

Рис. Транспорт из хлоропластов дигидроацетонфосфата (ДГАФ), энергетических и восстановительных эквивалентов.

Переносчиком высокого восстановительного потенциала НАДФH может служить система ЩУК-малат, каждый компо­нент которой легко проходит через мембраны, совершая циклические перемещения между хлоропластом и цитоплазмой. В пользу этой гипотезы говорит то, что в хлоропластах находятся НАД⁺- и НАДФ ⁺ - зaвисимые малатдегидрогеназы .

Первичные продукты фотосинтеза, включаясь в реакции вторичного метаболизма, служат источником энергии и углерода для разнообразных конструктивных процессов в растительной клетке. Интермедиаты цикла Кальвина и С₄-пути (эритрозо-4-фосфат, рибозо-5-фосфат, триозы, гексозы и др.) включаются в синтез липидов, циклических соединений, нуклеотидов, органиче­ских кислот, аминокислот и других органических соединений. Часть этих ве­ществ используется самими хлоропластами для построения липопротеидных мембранных структур, пигментов, компонентов ЭТЦ, а также коферментов и ферментов, катализирующих весь комплекс фотосинтетических реакций. Од­нако значительная часть образующихся в процессе фотосинтеза веществ, транс­портируется из хлоропластов в цитоплазму и включается в общий метаболизм растений. На изолированных хлоропластах показано, что оболочка хлоропласта практически непроницаема для сахарозы. По-видимому, основным местом синтеза сахарозы в клетке является не хлоропласт, а цитоплазма. На это указывает также присутствие основного сахарозосинтезирующего фер­мента сахарозофосфатсинтетазы и УДФ-глюкозопирофосфорилазы преимущественно в цитоплазме (рис.).

Рис. Схема выгрузки углеводов в цитоплазму и синтез сахарозы.

Таким образом, в ходе описанных превращений богатые энергией соединения (ФГА, ДГАФ - фосфодиоксиацетон или дигидрооксиацетонфосфат) переносятся из хлоропластов в цитоплазму, где преобразу­ются в ФГК с образованием НАДФН и АТФ. Углеводы в виде триозофосфатов (ФДА) выгружаются в цитоплазму в обмен на Фн. И используются на синтез сахарозы. Фотосинтетическая деятельность клеток мезофилла обогащает ткани листа не толь­ко сахарами, но и другими продуктами фотосинтеза. К транспортным формам орга­нических соединений, хорошо переносимым по флоэме (помимо сахарозы), также от­носятся рафиноза, стахиоза и вербаскоза, сахароспирт маннит, глутаминовая кисло­та и глутамин, производные мочевины — аллантоин и цитруллин. В процессах оттока синтезируемых в ходе фотосинтеза органических соединений и их распределения по растению основная роль принадлежит флоэме.

Транспорт по флоэме. На рис. приведено схематическое строение фрагмента флоэмы покрытосемен­ных растений, включающего ситовидные трубки и клетки-спутники. Ситовидные эле­менты отделяются друг от друга перегородкой, называемой ситовидной пластинкой. В зрелых ситовидных трубках имеется небольшое число редуцированных митохон­дрий и пластид, отсутствуют ядро и тонопласт и содержится большое количество Р-белков.

Рис. Схематическое строение фрагмента флоэмы.

Р-белки выполняют главным образом защитные функции, запечатывая поры си­товидных пластинок при ранениях. При длитель­ном повреждающем воздействии и к наступлению зимы ситовидные элементы запе­чатываются полисахаридом каллозой, которая откладывается между плазматической мембраной и клеточной стенкой. Молекула каллозы содержит около 100 остатков глюкозы, соединенных между собой (1—3)-гликозидными связями. Весной или при устранении повреждения каллоза гидролизуется до глюкозы, и поры ситовидных пла­стинок открываются.

Клетки-спутники, или сопровождающие клетки, имеют большое количество органелл, особенно митохондрий и рибосом. Эти небольшие вытянутые вдоль ситовид­ных трубок клетки имеют крупное ядро и многочисленные выросты плазмалеммы, что резко увеличивает их поверхность. Они связаны с члениками ситовидных трубок многочисленными плазмодесмами. Транспорт ассимилятов в листе ориентирован от клеток мезофилла по клеткам-спутникам в ситовидные трубки и далее по всему расте­нию. Так осуществляется симпластный тип загрузки флоэмы. У растений с апопластным типом загрузки флоэмных окончаний в плазмалемме клеток листа и в первую очередь клеток спутников функционирует протонный насос, выкачивающий ионы Н⁺ наружу. Закисление апопласта способствует транспорту саха­розы и ионов К⁺ из клеток мезофилла. Одновременно на мембране ситовидных клеток активирует­ся переносчик, который в режиме симпорта переносит внутрь ситовидных клеток сахарозу и ионы Н⁺. Этот процесс осуществляется белками, сродство которых к сахарам возрастает при их протонировании и осуществляется загрузка флоэмы против конценцентрационного градиента. Считается, что симпластный тип загрузки также как и апопластный осуществляется против концентрационного градиента. Механизм симпластной загрузки объясняет гипотеза молекулярных ловушек, по которой диаметр пор в клеточных стенках по мере удаления от терминальных ситовидных клеток уменьшается, а размер транспортируемых молекул углеводов увеличивается в результате полимеризации. Загрузка ситовидных клеток осуществляется в терминальные и близкие к ним членики флоэмы.

Транспорт ассимилятов по клетке и между клетками по неспециализированным путям как было сказано выше называется ближним транспортом. Дальний транспорт по флоэме объясняет гипотеза Мюнха (1926), согласно которой в местах загрузки флоэмы возрастает концентрация и осмотический потенциал и как результат – поступает вода, что приводит к росту давления. В местах разгрузки концентрация веществ и давление снижаются и транспорт идет под давлением от места с высоким давлением туда где оно ниже. Разгрузка осуществляется по концентрационному градиенту симпластно. В листьях транспорт идет от малых пучков в сторону более крупных со средней скоростью 50-100 см/ч. Тот факт, что сахароза концентрируется именно в ситовидных трубках, хорошо демонстрирует поведение тли — ее стилет

Табл. Состав ксилемного и флоэмного сока:

Вещества (Моль/л)	Ксилема	Флоэма
Сахароза	_	450-470
Аминокислоты1	0,7-2,6	13-15
Калий	2,4-4,6	39,0-46,0
Натрий	2,2-2,6	4,4-5,2
Кальций	0,4-1,8	0,5-1,6
Магний	0,3-1,1	3,5-5,8
Нитраты	Следы	0,003
РН	5,9	8,0
1 В мг/мл

точно попадает в клетки флоэмы. Если срезать воткнутый в ситовидную трубку стилет тли, то можно проанализировать флоэмный сок. Состав флоэмного сока представлен в табл. Для сравнения дается состав сока ксилемы.

Регуляция транспорта по флоэме осуществляется донорно- акцепторными взаимодействиями. На уровне донора — это регуляция интенсивности фотосинтеза в хлоропластах, поступления триозофосфатов в цитоплазму и исполь­зования их на синтез сахарозы. Фотосинтез служит также ис­точником энергии для систем активного переноса ассимилятов через мембраны (АТФ для ионных насосов, субстраты для дыхания).

Ключевую роль в механизме флоэмного транспорта играет загрузка флоэмных окончаний, В основе этой загрузки в клет­ках флоэмы лежит работа Н⁺-помпы, которая активируется фитогормонами, прежде всего ауксином. Абсцизовая кислота блокирует Н⁺/К⁺ обмен. Как известно, содержание АБК воз­растает в тканях листа при неблагоприятных условиях, особен­но при водном дефиците.

Важнейшую роль в регуляции флоэмного транспорта играет интенсивность разгрузки флоэмы в зонах потребления ассимилятов. При ослаблении аттрагирующего действия акцеп­торных зон снижается продольный осмотический градиент в ситовидных трубках, а следовательно, и градиент гидроста­тического давления — главная движущая сила флоэмного транспорта. Уровень аттрагирующей способности акцепторных органов зависит от интенсивности их роста.

Донорно-акцепторная система включает донор (source) и акцептор (sink), соединенные канализированными системами транспорта веществ и передачи информационных сигналов. Аттрагирующий фактор определяет способность ориентировать на себя поток ассимилятов против концентрационного градиента. Система сигналов гормональной, электрофизиологической, метаболитной или осмотической природы, поступающих от акцептора к донору. Сигналы несут к донору информацию о «запросе» аттрагирующего центра и составляют основу обратной связи в эндогенной регуляции фотосинтеза.

«Запрос», поступивший от акцептора, служит сигналом к изменению интенсивности фотосинтеза. Это достигается быстрой регуляцией активности ЭТЦ и фермен­тов углеродных циклов, обеспечивающих поддержание фотосинтеза на необ­ходимом уровне. В аттрагирующих центрах происходит либо новообразование и рост структур, либо интенсивный одно­направленный синтез запасных веществ (плоды, клубни, луко­вицы). В обоих случаях состояние аттрагирующих центров определяет величину «запроса» на фотосинтез. Донор асси­милятов (фотосинтез) и их акцептор (процессы роста и от­ложения веществ в запас) представляют собой взаимосвязан­ную систему. Если внешние условия не лимитируют фотосинтез, то ведущая роль в его детерминации принадлежит именно эпигенетическим процессам (появлению и развитию новых органов). Это положение может быть проиллю­стрировано многочисленными фактами. Так, удаление молодых початков у кукурузы, плодов у томатов, баклажанов или яблони вызывает значительное и устойчивое снижение фотосинтетической активности листьев. Удаление части листьев растения при сохранении прежней активности аттрагирую­щих центров обычно сопровождается увеличением фотосинте­тической активности оставшихся листьев.

Механизм этих взаимоотношений основан на явлении мета­болической репрессии фотосинтеза. Чем мощнее центры, аттрагирующие ассимиляты, тем эффективнее фотосинтезирующий лист освобождается от ассимилятов, что служит необ­ходимым условием интенсивного фотосинтеза.

Во всех этих процессах важнейшую роль играют фитогормоны и эндогенные ингибиторы роста и метаболизма (не­которые полифенолы). Участие фитогормонов в процессах фотосинтеза можно представить в виде схемы, предложенной А. Т. Мокроносовым (1983). Согласно этой схеме, фитогормоны образуются в разных частях растений, в том числе в хлоропластах, и дейст­вуют на процессы фотосинтеза как дистанционно, так и не­посредственно на уровне хлоропластов. Дистанционное дей­ствие осуществляется благодаря регулирующему влиянию фи­тогормонов на процессы роста и развития (эпигенез), на от­ложение веществ в запас, на транспорт ассимилятов, т. е. на формирование и активность аттрагирующих центров. С другой стороны фитогормоны оказывают прямое действие на функ­циональную активность хлоропластов через изменение состоя­ния мембран, активность ферментов, генерацию трансмем­бранного потенциала. Доказана также роль фитогормонов, в частности цитокинина, в биогенезе хлоропластов, синтезе хлорофилла и ферментов цикла Кальвина.

Ряд фитогормонов (индолилуксусная кислота, гиббереллины, абсцизовая кислота), а также некоторые физиологически активные фенолы образуются в тканях листа. Такая система создает взаимозависимость всех органов, обеспечивая регуляцию функциональной активности в целом растении.