1.2. Возможности тест-методов в экологическом контроле водной среды.

1.2.1. Понятие тест-методов экологического контроля, их возможности и ограничения.

Классические химические тест-методы анализа детально рассмотрены в монографии [17].

Общий принцип почти всех химических тест-методов — это использование аналитических реакций и реагентов в условиях и формах, обеспечивающих получение легко измеряемого (или наблюдаемого) эффекта. Тест-системы для реализации химических тест-методов представляют собой простые, портативные, легкие и дешевые средства для обнаружения и определения веществ без существенной пробоподготовки, а иногда без отбора пробы. Этот подход в последние годы стал весьма популярным по двум причинам. Во-первых, тест-методы удобны для предварительной оценки наличия и содержания компонентов (методология скрининга), во-вторых, тест-методы удобны при проведении внелабораторных измерений. Действительно, химический анализ постепенно перемещается из лабораторий к тем местам, где находится анализируемый объект [18,19].

Это одна из важнейших тенденций развития аналитической химии, в англоязычной научной литературе для обозначения внелабораторного анализа используют термины Field Analysis или On-site Analysis. Последний вариант является английской калькой более привычного нам латинского термина in situ, подразумевающему производство измерений непосредственно в неживой среде, в отличие от измерений в живом организме (in vivo) и от измерений отобранной пробы во внешнем по отношению к среде анализаторе (in vitro).

В [17] приведены данные В.Г. Амелина об оценке воспроизводимости некоторых тест-методов, основанных на применении индикаторных бумаг. Воспроизводимость оценивалась относительным стандартным отклонением (S_r). Были использованы различные способы определения концентрации. В области нижних границ определяемых содержаний наименьшее значение S_r получено для тест-титрования и при использовании тест-трубок (< 0,1). При определении концентрации по длине или площади окрашенной или обесцвеченной зон бумажных тест-полос получены значения S_r <0,3, а при визуальной оценке интенсивности окраски жидкости S_r <0,4. Наименее точно определяется концентрация по интенсивности окраски реактивных бумаг (S_r <0,5). Приведенные значения S_r получены на реальных объектах при минимально определяемых данным способом концентрациях и при надежности 0,95. При больших значениях определяемых концентраций величина S_r имеет, как правило, меньшее значение. Применение портативных приборов для измерения коэффициентов диффузного отражения тест-форм позволяет значительно улучшить воспроизводимость определений (S_r< 0,08). Здесь используется зависимость функции Гуревича—Кубелки—Мунка F = (1 - R)²/2R, где R — коэффициент диффузного отражения образца от концентрации определяемого вещества при данной длине волны.

Что касается предела обнаружения тест-методов, то при общем стремлении к созданию чувствительных методов всегда нужно руководствоваться принципом «необходимо и достаточно». Действительно, при анализе объектов окружающей среды прежде всего нужны средства, позволяющие определять нормируемый компонент на уровне несколько более низком, чем предельно допустимая концентрация этого компонента в данном объекте.

По критерию селективности тест-методы могут быть классифицированы на три основные группы: селективные, неселективные и сравнительные (компаративные). Классификация тест-методов контроля объектов окружающей среды по их селективности приведена на рисунке 1 [20].

Учитывая исторически сложившуюся ситуацию, можно считать, что доминирующие в настоящее время селективные тест-методы не являются самыми перспективными. Действительно, по состоянию на август 2006 года число известных химических соединений достигло 88 миллионов [21], из них не менее 800 тысяч активно используют в мировом хозяйстве. Естественно, что «охватить» селективными тест-методами удается только наиболее опасные соединения: боевые отравляющие вещества, некоторые приоритетные загрязняющие вещества в воде и в атмосфере.

Поэтому представляется наиболее важным развивать неселективные тест-методы, с помощью которых можно было бы определить негативную реакцию выделяемого природного объекта или всей контролируемой экосистемы на воздействие любых (в том числе и неизвестных сегодня) веществ, способных вызывать эту негативную реакцию. Ниже мы обсудим выбор тех свойств и компонентов природных вод, отклик которых на аварийные или нелегальные загрязнения позволяет решить поставленную задачу. Кроме того, отсутствие четко определенного понятия «норма» по отношению к природным объектам и экосистемам требует развития сравнительных тест-методов. Наибольшая сложность заключена в корректном выборе значений измеряемого тест-системой параметра, при достижении которого должен быть подан сигнал тревоги [22]. Хорошо, если речь идет об известном веществе с нормативно установленной ПДК в данной среде. А если речь идет о неизвестных веществах в условиях неселективного тестирования?

Тест-методы контроля объектов окружающей среды

НЕСЕЛЕКТИВНЫЕ

СЕЛЕКТИВНЫЕ

СРАВНИТЕЛЬНЫЕ

Характеристики объекта получают путем контроля содержания в нем группы веществ

Характеристики объекта получают путем контроля содержания в нем индивидуальных веществ

Характеристики объекта получают путем сравнения его признаков с признаками эталонного образца

По интегральному показателю (суммарное количество вещества)

По обобщенному показателю (суммарное свойство веществ)

По сравнению с реально существующим эталоном (стандартное вещество, проба-улика, проба-свидетель)

По сравнению со статистически определяемым эталоном («нормальное» состояние объекта контроля)

Рисунок 1 — Классификация тест-методов контроля объектов окружающей среды по их селективности [20]

Выход в том, чтобы изучить статистические характеристики изменения контролируемых параметров для данного водного объекта, данного времени года, определить максимально вероятные результаты с учетом их суточных и сезонных колебаний, с учетом гидрометеорологических условий — тогда любое отклонение показаний тест-системы от этой статистической «нормы» и будет основанием для выработки «сигнала тревоги», для отбора пробы с целью детального ее исследования высокоселективными и высокочувствительными методами химического анализа в стационарных лабораториях [22].

В подземных и морских водах концентрации растворенного органического углерода находятся практически в одном диапазоне, их средние значения составляют 0,7 мг/л и 1 мг/л соответственно. Однако в подземных водах концентрация растворенного органического углерода может увеличиваться до 15 мг/л, а в морских колеблется от 0,3 до 2 мг/л. В реках и озерах изменение в содержании растворенного органического углерода намного выше, но наиболее распространены концентрации, не превышающие 10 мг/л [23]. Высокие концентрации органического углерода характерны для вод северных регионов [24], хотя, например, в водах Финляндии диапазон концентраций весьма широк 5-30 мг/л [25].

Любое значимое для водной экосистемы воздействие неизбежно скажется на состоянии РОВ. Обмен веществ в водных экосистемах при участии органических и неорганических метаболитов, выделяемых в воду одними организмами и потребляемых другими, составляет основу экологического метаболизма [26,27]. Изучение состава РОВ в различных системах «одноклеточные водоросли – сопутствующие бактерии» в реальных водных экосистемах (как речных, так и морских) обнаружило удивительное сходство в соотношении основных молекулярных классов РОВ: практически стандартный набор аминокислот, углеводов, органических кислот и спиртов. Единственное значимое отличие РОВ пресных вод рек и озер от РОВ морской воды – присутствие растворимых фракций гумусовых веществ, в первую очередь, гуминовых кислот, активно ассимилируемых бактериопланктоном.

Это свидетельствует о том, что в сообществах водорослей и сопутствующих бактерий протекают однотипные биохимические процессы, приводящие в нормальных условиях существования водной экосистемы к формированию одинакового набора автохтонных внешних метаболитов, то есть, существует биохимический механизм, поддерживающий оптимальное постоянство среды обитания (гомеостаз).

Численность бактериальных клеток в пресных водах составляет 1 – 30 миллионов в миллилитре, время жизни бактерий не более одного часа [28], а отклик бактериальной системы на химическую «атаку» или «подкормку» заметен по количеству и свойствам РОВ уже через несколько минут: при гибели клеток идут быстрые процессы цитолиза, при активном размножении – пиноцитоза, суммарная скорость метаболических процессов простейших организмов очень велика [29].

Именно поэтому наиболее активную роль в трансформации РОВ играют среди водных организмов их мелкие и мельчайшие формы. Наряду с бактериопланктоном в трансформации РОВ участвуют некоторые виды микроводорослей с миксотрофным типом питания, а доля других форм водной биоты в наработке и деструкции РОВ не превышает 10 – 20% при существенно меньшей скорости этих процессов, что делает пренебрежимо малым их вклад в быстрый отклик водной экосистемы на загрязнение.

Поскольку в водных экосистемах масса РОВ значительно выше, чем масса простейших организмов [30], не удивительно, что РОВ имеет большее экологическое значение. Хотя общая биомасса бактериопланктона колеблется около некоторого постоянного уровня, определяемого величиной первичной продукции водной экосистемы, суммарное содержание РОВ меняется. Процессы переноса, растворимости, разложения, испарения и бионакопления антропогенных органических соединений влияют на формирование состава РОВ [31] и могут в значительной степени контролироваться его содержанием [32]. Чтобы оценить степень химического воздействия на природные воды необходимо получить информацию о количестве и качестве РОВ. С ростом антропогенной нагрузки, как правило, возрастает не только общая концентрация РОВ, но и доля трудноокисляемых его компонентов. Это характерно как для вод, так и для почв и донных осадков [33].

Таким образом, содержание и свойства РОВ находящихся в макроколичествах и имеющих сходный состав во всех водных экосистемах, зависят от воздействия негативных химических факторов, любой неизвестной нам природы присутствующих в ничтожно малых, трудноопределяемых концентрациях. Поиск неизвестных опасных факторов обычно происходит с помощью биотестирования, когда живой объект — биотест помещают в исследуемую среду или биоиндикации, когда по состоянию аборигенного вида (автохтонного) индикатора судят о состоянии исследуемой среды.

Если классифицировать тест-методы контроля объектов окружающей среды по их механизму, то можно представить три основные группы методов: химические, биохимические и биологические. Предлагаемая классификация приведена на рисунке 2.

Наиболее тщательно разработаны ставшие привычными для экоаналитики реагентные химические методы, в основу которых положены специфические или неспецифические цветные реакции с участием индикаторов (реагентов), введенных в тест-систему.

Наиболее удобны безреагентные методы, где необходимый реагент, например, окислитель, тест-система вырабатывает самостоятельно. Это существенно облегчает возможность создания автоматических датчиков, которые не требуют обслуживания в процессе работы [34,35].

Биохимические тест-методы, в основном, базируются на различных вариантах проведения иммуноферментного анализа с участием специально выделенных биоорганических соединений. Классические биологические методы — биотестирование и биоиндикация основаны на реакции организмов на воздействие отдельных негативных факторов, а чаще на сумму негативных факторов. Характерно, что только метод биоиндикации может информировать о состоянии экосистемы, поскольку основан на реакции организмов автохтонной (аборигенной) природы, характерных для данной экосистемы.

Тест-методы контроля объектов окружающей среды

Химические

Биохимические

Биологические

П о изменению свойств выделенных биоорганических соединений в присутствии пробы тестируемой среды

Реагентные

Безреагентные

Биоиндикация

Биотестирование

По возникновению и/или изменению процессов с участием реагентов, введенных в тест-систему до или после ее экспозиции в тестируемой среде

П о возникновению и/или изменению процессов с участием реагентов или иных факторов, вырабатываемых тест-системой под действием внешней энергии, приложенной к тест-системе или к тестируемой среде

По изменению поведения и/или выживаемости аллохтонного организма — биотеста, внесенного в тестируемую среду или в пробу этой среды

Организменная

Цитогенетическая

Молекулярная

По изменению состояния и /или видового состава автохтонных организмов экосистемы, постоянно обитающих в тестируемой среде

По изменению числа генетических нарушений в клетках автохтонных организмов, постоянно обитающих в тестируемой среде

По изменению состава и/или свойств совокупности молекул автохтонного биогенного вещества экосистемы, находящегося в динамическом равновесии с биотой тестируемой среды

Рисунок 2 — Классификация тест-методов контроля объектов окружающей среды по их механизму

Представляется необходимым выделить еще один метод биоиндикации, который также может дать информацию о состоянии экосистемы, но не по отклику на уровне автохтонных организмов, а по отклику на уровне автохтонного биогенного вещества экосистемы, находящегося в динамическом равновесии с биотой. Поскольку речь идет не о виде-индикаторе, а о молекулах биогенных веществ-индикаторов, то эти тест-методы по нашему мнению можно назвать методами молекулярной биоиндикации.

Подтверждением этого мнения является недавнее создание еще одного метода биоиндикации, занимающего промежуточное положение между биоиндикацией на уровне организма и биоиндикацией на молекулярном уровне. Это — цитогенетическая биоиндикация, основанная на определении числа мутаций в клетках организма, постоянно обитающего в исследуемой экосистеме [36].