Три первые цифры количества эритроцитов в 1 мкл'

Например, в 1 мкл крови содержится 4 500 ООО эритроцитов, концентрация гемоглобина 120 г/л. В этом случае цветовой пока­затель будет равен 3 • 120/450 = 0,8.

В норме цветовой показатель равен 1 или близок к ней. Сниже­ние его до 0,8 и ниже (гипохромия) свидетельствует о слабом на­сыщении эритроцитов гемоглобином, что отмечается при железо-дефицитной анемии. Увеличение цветового показателя выше 1 (гиперхромия) отмечается при В[2- и фолиеводефицитных, ги-попластических анемиях. При острых кровотечениях, хронических лейкозах, некоторых гемолитических анемиях отмечается нор-мохромная анемия, при которой цветовой показатель близок к 1.

3.3. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КРОВИ

В клинической ветеринарии для оценки состояния обмена ве­ществ, функции сердца, печени, почек, желудочно-кишечного тракта, эндокринных и других органов, для диагностики различ­ных болезней используют множество биохимических методов ис­следования крови, мочи, молока, рубцового содержимого и других субстратов. При этом особое значение имеет исследование крови, так как оно позволяет оценить состояние обмена веществ на раз­личных его стадиях.

Стадии метаболизма. Под метаболизмом (обмен веществ) пони­мают совокупность процессов превращения веществ и энергии в организме, обеспечивающих его жизнедеятельность во взаимосвя­зи с внешней средой. Обмен веществ и энергии включает четыре стадии.

Первая стадия метаболизма — пищеварение. В эту ста­дию у моногастричных животных белки корма под действием про-теолитических ферментов желудка расщепляются до аминокислот. Липиды под действием липаз и желчных кислот расщепляются до жирных кислот и глицерола (глицерина). Углеводы (ди- и полиса­хариды) под влиянием амилаз превращаются в моносахариды.

У жвачных животных белки корма в преджелудках (в основном в рубце) под действием ферментов микрофлоры расщепляются до аминокислот и аммиака, которые частично всасываются, а в боль­шей степени усваиваются микрофлорой и используются для син­теза микробного белка. Бактерии и инфузории отмирают, попада­ют в сычуг и кишечник, где бактериальный белок расщепляется до аминокислот. Протеолиз и дезаминирование аминокислот в рубце происходят с высокой скоростью. При недостатке энергии синтез микробного белка задерживается, аммиак не полностью усваивает­ся микрофлорой, поступает в повышенных количествах в кровь и печень, вызывает нарушение функций важнейших органов и сис­тем, прежде всего дистрофию печени и почек. Липиды корма в рубце расщепляются до летучих жирных кислот (ЛЖК). Углеводы корма сбраживаются до ЛЖК (уксусной, масляной, пропионовой и др.). Уксусная и масляная кислоты являются основными источ­никами синтеза жира, в том числе жира молока. Пропионовая кис­лота — основной источник глюкозы. В свою очередь, исходным материалом для пропионовой кислоты служит молочная кислота, ко­торая образуется в процессе сбраживания легкоусвояемых углеводов — сахара и крахмала. Потребность жвачных в глюкозе практически полностью (90 % и более) зависит от структуры рациона, обеспе­чивается глюконеогенезом. Источниками при этом являются про-пионат, глицерол, аминокислоты, лактат с пируватом (А. А. Алиев, 1997). Поэтому для животных этих видов важно поддерживать в рационах оптимальное сахаро-протеиновое отношение (0,8—1,2).

Вторая стадия метаболизма включает в себя всасывание аминокислот, частично аммиака у жвачных животных, жирных кислбт, глицерола, ЛЖК, моносахаридов (глюкоза, лактоза, фрук­тоза, маноза) и их транспорт кровью и лимфой к органам и тка­ням. В эту же стадию осуществляется трансмембранный перенос продуктов распада белков, углеводов и липидов в клетки разных тканей и органов.

Третья стадия метаболизма осуществляется в тканях и органах. В эту стадию происходит синтез белков, липидов, моноса­харидов, липопротеинов и других веществ с потреблением энергии; окислительно-восстановительный распад белков до аминокислот, липидов — до жирных кислот и глицерола, ди- и полисахаридов — до моносахаридов. Основным промежуточным продуктом распада липидов, углеводов и частично белков является ацетил-КоА, кото­рый вступает в цикл трикарбоновых кислот (ЦТК), образуя различ­ные продукты обмена.

Четвертая стадия метаболизма включает в себя выде­ление конечных продуктов обмена веществ. Конечные продукты обмена азотсодержащих веществ — мочевина, мочевая кислота, аммиак, креатин, креатинин, аминокислоты и др., метаболизма уг­леводов и липидов — СО2 и Н2О. Минеральные вещества экскре-тируются в основном с мочой и калом.

На второй и третьей стадиях метаболизма осуществляется энер­гетический обмен — высвобождение, запасание и использование энергии. На стадиях окислительно-восстановительного распада белков, липидов и углеводов с образованием ацетил-КоА, его пре­вращения в ЦТК высвобождается энергия химических связей. Она затрачивается в последующем на эндогенный синтез различных веществ. Аденозинтрифосфорная кислота (АТФ), образовавшаяся из аденозиндифосфорной кислоты и неорганического фосфора, используется как источник энергии для всех видов работ, произво­димых организмом.

Обмен веществ осуществляется благодаря многочисленным ферментным реакциям, регулируется нейроэндокринной систе­мой, находится под постоянным контролем автоматической само­регуляции, в основе которой лежит принцип обратной связи. Кон­центрация веществ в клетке регулирует направленность химиче­ских процессов.

Регуляторные системы поддерживают обмен веществ на опре­деленном уровне, обеспечивают гомеостаз — относительное дина­мическое постоянство внешней среды (крови, лимфы, тканевой жидкости) и устойчивость основных физиологических функций организма.

Нарушение обмена веществ может быть на любой или на всех стадиях метаболизма, что должно учитываться при определении наиболее информативных биохимических показателей.

3.3.1. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНО-ОСНОВНОГО РАВНОВЕСИЯ(КОР)

Постоянство равновесия рН в организме поддерживается че­тырьмя основными буферными системами — гемоглобиновой, би-карбонатной, фосфатной и белковой. Перечисленные буферные системы представляют собой смесь слабой кислоты и соли этой кислоты. Благодаря им обеспечивается перемещение ионов от мест их образования к местам выделения почками, легкими без на­рушения рН крови. рН крови постоянный (7,35—7,45), и измене­ние его выше 7,8 и ниже 6,8 несовместимо с жизнью; в клиничес­кой практике не наблюдается.

Кислотно-щелочное состояние, кроме рН, характеризуется по­казателями буферных систем, в первую очередь бикарбонатной как наиболее лабильной (время реакции — 30 сек). Бикарбонатная буферная система представлена слабой угольной кислотой (Н₂С0₃) и ее солью (NaHC0₃).

Состояние КОР оценивают по следующим показателям крови:

рН — актуальная величина рН артериальной, капиллярной или смешанной венозной крови определяется без доступа воздуха при температуре 37 °С (норма 7,35—7,45);

рС0₂ — актуальное рС0₂ определяется без доступа воздуха (норма артериальной крови 35—45 мм рт. ст., венозной — 46—58 мм рт. ст.);

АВ — актуальное (истинное) содержание бикарбоната в плазме, рассчитанное при истинном рС0₂ и истинном насыщении крови кислородом (норма 19—25 ммоль/л);

SB — стандартный бикарбонат — рассчитанное содержание би­карбоната в плазме при насыщении крови кислородом 100 %, рС0₂ = 40 мм рт. ст. и при температуре 37 °С (артериальная кровь 20—27 ммоль/л, венозная — 20—29 ммоль/л);

ВЕ-В — рассчитанный истинный избыток оснований крови, из­меряется в ммоль/л;

ВВ — буферные основания — связующее звено между КОР и электролитами, непосредственно участвующее в поддержании за-

кона электронейтральности. Сумма бикарбоната и белка составля­ет 45—50 ммоль/л. Она остается неизменной при дыхательных рас­стройствах;

BE — избыток или дефицит оснований. Показывает, сколько ммоль кислоты или основания следует добавить в 1 л внеклеточ­ной жидкости для восстановления нормального рН (от —3,4 до +1д«моль/л);

pOj — напряжение кислорода, отражает концентрацию раство­ренного в плазме О2 (pOj артериальной крови 72—105 мм рт. ст.).

Определение перечисленных показателей проводится на специ­альных приборах в стационарных условиях. Для определения КОР, калия, натрия, хлора, глюкозы лактата предложены анализаторы ABL поколения 500, 600, 700 (Дания), NOVA стат-профили 2—11 (Австрия), анализаторы газов крови серии 800 (Германия), IL се­рии 1300 (США).

В настоящее время на российском рынке достаточно фирм, вы­пускающих анализаторы для определения КОР крови (ЭЦ-60 и др.). В ветеринарии анализаторы КОР используются крайне редко.

Состояние бикарбонатной буферной системы проводят по опре­делению в плазме крови резервной щелочности. Под резервной ще­лочностью понимают запас бикарбонатов крови, определяемый по общему СО2. Известно, что углекислый газ в основном содержится в составе бикарбонатов крови и только 1/20 его часть находится в рас­творенном и свободном состоянии. Такая малая доля существенно не влияет на оценку состояния бикарбонатной системы по общему СО2.

3.3.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЗЕРВНОЙ ЩЕЛОЧНОСТИ КРОВИ ДИФФУЗНЫМ МЕТОДОМ ПО И. П. КОНДРАХИНУ

Принцип метода. В одной половине колбы плазму крови обрабатывают серной кислотой, в результате чего выделяется угле­кислый газ, входящий в состав бикарбонатов. Выделившийся угле­кислый газ поглощается раствором натрия гидроксида, который находится в другой половине колбы. Избыток натрия гидроксида, не вошедший в реакцию с углекислым газом, и половину натрия гидрокарбоната (^гСОз), образовавшегося в процессе поглоще­ния СО2, оттитровывают раствором серной кислоты. По количес­тву первоначально связанного натрия гидроксида определяют ко­личество выделенного из плазмы углекислого газа, которое экви­валентно содержанию бикарбонатов.

Реактивы: 0,1 н. (0,05 моль/л) раствор серной кислоты (го­товят из фиксанала);

0,02 н. (0,01 моль/л) (точно) раствор серной кислоты (готовят из 0,1 н. раствора серной кислоты); 0,1 н. (0,1 моль/л) раствор натрия гидроксида;

0,02 н. (0,02 моль/л) раствор натрия гидроксида (готовят из 0,1 н. раствора натрия гидроксида). Титр этого раствора проверяют перед анализом и доводят до нужной величины;

5 %-ный раствор серной кис­лоты;

1 %-ный спиртовой раствор фе­нолфталеина.

Оборудование: сдвоен­ные колбы с резиновыми пробка­ми (рис. 1). Они должны быть хо­рошо вымыты без следов щелочи и кислоты; микробюретки на 2 и 5 мл; центрифужные пробирки.

Ход определения. В чистые сухие центрифужные про­бирки вносят 0,5—1,0 мл вазели­нового масла, 1—2 капли 1%-ного раствора гепарина. Кровь берут из яремной вены в подготовленную пробирку под слой вазелинового масла, закрывают пробкой, осто­рожно перемешивают. В лабора­тории центрифугируют ее при

3000 мин^-1 в течение 15 мин. Плазму крови хранят в бытовом 4 °С. Анализ проводят в течение

холодильнике при температуре 8—12 ч после взятия образца крови.

По количеству проб крови с учетом параллельных исследова­ний подбирают сдвоенные колбы и три сдвоенные колбы оставля­ют для контроля. Точность результатов всей серии исследований полностью зависит от точности титрования раствора натрия гид­роксида в контрольных колбах. Все колбы закрывают резиновыми пробками.

Анализы проводят серийно. В одну из каждой пары сдвоенных колб, поочередно открывая, вносят с помощью пипетки и шприца или резиновой груши по 2 мл 0,02 н. раствора натрия гидроксида и плотно закрывают пробкой. В смежную колбу, кроме контроль­ных, опять поочередно открывая и закрывая, вносят 0,5 мл плаз­мы крови, находящейся под вазелиновым маслом. После этого в колбы с плазмой (контрольные без плазмы), также поочередно открывая, вносят из пипетки (не выдувая) по 1 мл 5%-ного рас­твора серной кислоты и быстро плотно закрывают пробкой. Проверяют, хорошо ли закрыты колбы, осторожно вращатель­ными движениями перемешивают плазму крови с кислотой и оставляют стоять в течение 4 ч. Перемешивают плазму с кисло­той не менее 3 раз.

Через 4 ч приступают к титрованию. Для этого поочередно от­крывают колбу, где находится раствор натрия гидроксида, вносят туда 1—2 капли раствора фенолфталеина и титруют из микробю­ретки на 2 мл 0,02 н. раствором серной кислоты до полного обес­цвечивания раствора. Опытные и контрольные пробы титруют с одинаковой скоростью.

Расчет. По разнице результатов титрования в контрольных и опытных образцах определяют количество мл 0,02 н. раствора натрия гидроксида, связанного с углекислым газом, вытесненным из бикарбонатов плазмы.

Расчет ведут по формуле

_х = !_к " ' = ЮО, или (У_к - У_п) • 89,6,

где х — количество СОг, об.%; У_к — количество 0,02 н. раствора серной кислоты, пошедшего на титрование контроля, мл; V_n — количество 0,02 н. раствора серной кислоты, пошедшего на титрование исследуемого образца, мл; У_пл — количество плазмы крови, мл (в методике принято равным 0,5 мл); 0,448 — коэффициент пересчета 0,02 н. раствора натрия гидроксида на СО2 в условиях данной реакции; 100 — коэффициент для пересчета результатов анализа на 100 мл плазмы крови.

В конечном счете разницу количества (мл) 0,02 н. раствора сер­ной кислоты, пошедшего на титрование контрольного и опытного образцов, умножают на коэффициент 89,6 и получают конечный результат в об.% СО2. Ошибка метода составляет +3 %.

Источники: 29, 34.

Нормативы величины резервной щелочности плазмы крови жи­вотных представлены в приложениях 5 и 6.

Снижение резервной щелочности крови свидетельствует о сдвиге кислотно-щелочного равновесия в сторону ацидоза, повышение — в сторону алкалоза.

Метаболический ацидоз отмечают при однотипном высоко-концентратном или силосо-жомовом кормлении, кетозе, вто­ричной остеодистрофии, ацидозе рубца, сахарном диабете, рас­стройствах желудочно-кишечного тракта, особенно при диарее молодняка, сердечной недостаточности, миоглобинурии, гипок­сии, нефрите, почечной недостаточности, септических процес­сах и т. д. Респираторный ацидоз бывает вследствие замедления процесса отдачи углекислоты легкими. Такое явление наблюда­ется при расстройстве сердечной деятельности, отеке легких, тя­желой пневмонии, угнетении дыхательного центра, нахождении животных в среде с высокой концентрацией углекислоты в воз­духе.

Состояние метаболического алкалоза у животных бывает при ал­калозе рубца, введении в организм больших доз пищевой соды. Респираторный алкалоз наблюдается при усиленной гипервентиля­ции легких, вследствие выведения из организма большого коли­чества углекислого газа, а также при содержании животных на большой высоте.

3.3.3. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ

ВОДНО-ЭЛЕКТРОЛИТНОГО И МИНЕРАЛЬНОГО ОБМЕНОВ

Состояние водно-электролитного обмена оценивают по содер­жанию в крови натрия, калия, кальция, фосфора, магния, хлора.

Определение калия и натрия в биологических жидкостях методом пламенной фотометрии. В современных биохимических лаборато­риях измерение концентрации натрия и калия в биологических жидкостях проводится одновременно пламенной фотометрией или ионометрией.

Пламенная фотометрия представляет собой один из видов эмис­сионного спектрального анализа, основанного на фотометрирова-нии излучения элементов в пламени.

Принцип. Анализируемый раствор в виде аэрозоля вводят посредством специального распылителя, действующего под давле­нием сжатого воздуха, в пламя горелки, работающей на горячем газе (пропане, метане, бутане). В пламени молекулы распадаются на отдельные ионы, их электроны переходят из одного квантового состояния в другое, результатом чего является испускание кванта света. Натрий и калий способны интенсивно излучать свет в срав­нительно низкотемпературном пламени, образованном сгоранием горючего газа в воздухе. Возникшее в пламени излучение опреде­ляемого элемента отделяется посредством светофильтров от излу­чения других элементов и, попадая на фотоэлемент, вызывает фо­тон, интенсивность которого измеряется гальванометром.

Натрий окрашивает пламя в ярко-желтый цвет, калий — в сла­бый красно-фиолетовый. Добавление к распыленным растворам органических красителей, являющихся поверхностно-активными веществами, увеличивает яркость свечения пламени.

Реактивы: основные калибровочные растворы для опреде­ления натрия, калия в плазме (сыворотка), спинномозговой жид­кости, экссудатах, транссудатах, желудочном содержимом и эрит­роцитах. Готовят их из химически чистых солей: натрия хлорида, калия хлорида, кальция карбоната, дважды перекристаллизован­ных и высушенных до постоянной массы:

стандартный раствор натрия основной: 2,5418 г натрия хлорида, высушенного до постоянной массы при температуре 105 °С, рас­творяют в 1 л бидистилированной воды. В 1 мл раствора содержит­ся 1 мг натрия;

стандартный раствор калия основной: 1,9069 г калия хлорида, высушенного до постоянной массы при температуре 105 °С, рас­творяют в 1 л бидистиллированной воды. В 1 мл раствора содер­жится 1 мг калия;

2,4972 г кальция карбоната растворяют в 50 мл 1 н. (1 моль/л) раствора соляной кислоты в мерной колбе на 1 л и доводят бидис­тиллированной водой до метки.

Оборудование: пламенный фотометр отечественного или зарубежного производства; компрессор; колбы мерные; бюксы диаметром 10—15 см; баллоны с пропаном, метаном или бутаном; флаконы пенициллиновые.

Подготовка материала к анализу. Плазму получают в течение 1 ч после отбора проб крови. В качестве антикоагулянта ис­пользуют 1%-ный раствор гепарина из расчета 2 капли на 10 мл кро­ви. Кровь центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин '.

Плазма крови не должна иметь даже следов гемолиза. Любой гемолиз исключает выполнение анализа. В герметически закрытой пробирке сыворотку или плазму можно хранить при температуре 20—25 °С и 4—8 "С в течение 1 нед, при минус 20 "С в течение 1 года (W. Guder и соавт., 1996).

Для определения калия берут 0,5 мл плазмы, вносят в пеницил-линовый флакончик, добавляют из бюретки 9,5 мл дистиллирован­ной воды, закрывают резиновой пробкой и путем перевертывания тщательно перемешивают. Разведение соответствует 1 : 20.

Для определения натрия плазму крови разводят 1 : 100, для чего берут 1 мл разведенной 1 : 20 плазмы, вносят в другой флакончик и приливают 4 мл дистиллированной воды. Можно готовить раз­ведение плазмы 1 : 150.

Эритроциты. Гепаринизированную кровь центрифугируют в те­чение 40—45 мин при 3000 мин . Затем плазму с верхним слоем эритроцитов отсасывают. Эритроциты набирают пипеткой из ниж­ней части пробирки, разводят дистиллированной водой. Соотно­шение эритроцитов и воды подбирают в зависимости от предпола­гаемого содержания калия и натрия.

Желудочное содержимое предварительно разводят дистиллирован­ной водой 1 : 50, а затем добавляют дистиллированную воду до раз­ведения 1:10. Пересчитывают полученные результаты на разведение.

Ход определения. Определение ведут согласно инс­трукции, прилагаемой к прибору. При включении прибора сначала пропускают сжатый воздух, затем ацетилен или другой газ. В бюк-сы диаметром 10—15 см вносят подготовленную биологическую жидкость и соответствующий рабочий калибровочный раствор. Исследование начинают с настройки прибора.

Во время прогревания прибора в пламя горелки подают дистил­лированную воду и при помощи корректора устанавливают шкалу гальванометра на «0». В распылитель подают рабочие стандартные растворы (каждый не менее 2 раз) и записывают показания прибора.

Капилляр промывают дистиллированной водой и в пламя го­релки подают исследуемые пробы также не менее 2 раз. Показания прибора заносят в журнал исследований. Через каждые 5—6 проб распылитель промывают дистиллированной водой до тех пор, пока шкала гальванометра не установится на «0», и подают в распыли­тель рабочие стандартные растворы, в пределах которых укладыва­ются показания исследуемых проб.

После окончания исследования капилляр распылителя промы­вают 20 мин дистиллированной водой, отключают газ, а затем воз­дух, выключают прибор из электросети, закрывают диафрагму и фотоэлемент, снимают светофильтры.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика. Из основных калибровочных растворов готовят рабочие растворы, как указано в таблицах 6—9. Рабочие калибровочные растворы обрабатывают как опытные про­бы и по полученным данным строят калибровочный график.

б. Рабочие калибровочные растворы для определения калия в плазме, спинномозговой жидкости, транссудате, экссудате и желудочном содержимом

Основные калибровочные			Дистиллиро-	Концентрация калия в калибро-
	растворы, мл			вочном растворе
			ванная вода,
КО	NaCl	СаСОэ	мл	мг%	ммоль/л
1,2	16,5	0,2	82,1	12	3,08
1,6	16,5	0,4	81,5	16	4,10
2,0	16,5	0,5	81,0	20	5,12
2,4	16,5	0,6	80,5	24	6,15
2,8	16,5	0,8	79,9	28	7,18