3. Материал для исследования, аитикоагулянт, условия хранения образца, сроки анализа

Исследуемый показатель (вещество)

Материал для исследования, антикоагулянт

Срок хранения

Г

СК, свободная от гемолиза До 3 сут в холодильнике

ематокрит Гемоглобин

Глюкоза

Кетоновые те­ла

Резервная ще­лочность

Минеральные вещества:

фосфор неоргани­ческий

магний кальций

железо Белок общий

Белковые фракции

Билирубин

Холестерол (холестерин общий)

Витамины:

ретинол, каротин

ЦК, ЭДТА натрия

ЦК, ЭДТА натрия, воз­можны гепарин, оксалат

ЦК, ПК, натрия фторид. Осаждение белков в мо­мент взятия крови

ЦК, гепарин. Приготовле­ние безбелкового фильтра­та в день взятия крови

ПК, гепарин, ЭДТА и др.

СК, ПК, гепарин и др. Бы­стро отделить плазму, не допускать гемолиз

ПК, гепарин и др.; СК. Не допускать гемолиз

СК, ПК свободная от гемо­лиза

То же

СК, свободная от гемолиза; ПК, гепарин и др.

СК, свободная от гемолиза, ПК, гепарин

ПК, ЭДТА, гепарин, но не оксалат, цитрат, СК или ПК, свободные от гемолиза

СК, свободная от гемолиза

48 ч при 4 "С, 6 ч при 23 'С 48 ч при 4 "С, 24 ч при 23 'С

Центрифугат 8 ч при комнат­ной температуре, до 3 сут в бытовом холодильнике

Безбелковый фильтрат до 3 сут в холодильнике

До I сут в холодильнике

До 2 сут в холодильнике. При хранении содержание фосфора возрастает

До 5 сут в холодильнике До 3 сут в холодильнике

2—3 сут в холодильнике До 3 сут в холодильнике

Исследуют в течение 2 ч. За­щищают от солнечного света

До 5 сут в холодильнике

2 Нед в замороженном состоя­нии. Защищают от солнечного света

ПК, гепарин и др.; СК без следов гемолиза

3 Ч проба стабильна в охлаж­денной крови. Плазму и сы­воротку стабилизируют мета-фосфорной кислотой (6 г/100 мл), тху, или три-хлоруксусной (10 г/100 мл) кислотой. Хранят при 20 "с 21 сут

Исследуемый показатель (вещество)

Материал для исследования, антикоагулянт

Срок хранения

Ферменты: лактатде-гидрогена-за

аспартат-

ами-

нотранс-

фераза

аланин-

ами-

нотранс-

фераза

холинэсте-

раза

щелочная фосфотаза

СК, свободная от гемолиза

СК или ПК, свободные от гемолиза, гепарин

То же

СК или ПК, свободные от гемолиза, гепарин, ЭДТА натрия; цитратную или оксалатную плазму крови исследовать нельзя Свежая сыворотка крови, свободная от гемолиза

Несколько дней в холодильни­ке. Защищают от солнечного света

Не охлаждают, исследуют в день взятия крови

Не охлаждают, исследуют в день взятия крови

Не замораживают, исследуют в день взятия крови

6 Ч при комнатной температу­ре, 1 нед при 4 °с, 6 мес при минус 70 °с

СК охлаждают немедленно, исследуют быстро. При хране­нии активность фермента воз­растает

Обозначения: ЦК — цельная кровь; ПК — плазма крови; СК — сы­воротка крови.

Наборы реактивов. При лабораторных исследованиях использу­ют как отдельные реактивы (ч. д. а., х. ч.), так и их наборы. Для ла­бораторных анализов выпускают наборы реактивов заводского изготовления, снабженные инструкцией. При использовании их повышается гарантия качества выполняемых лабораторных ис­следований. При определении содержания гормонов, опухолевых маркеров, использовании автоанализаторов применяют только наборы реактивов заводского изготовления. К ним предъявляют определенные требования, в частности, срок хранения набора при определенных условиях (например, в холодильнике) должен быть не менее 6 мес со дня выпуска. Стабильность рабочих рас­творов, если возможно, должна сохраняться 1 нед, но не менее чем в течение рабочего дня. Качество реактивов должно быть га­рантировано.

Большинство наборов реактивов предназначены для определе­ния одного показателя, но имеются и такие, с помощью которых

в биологической жидкости можно устанавливать 2 вещества и бо­лее (например, холестерин и мочевую кислоту).

В лабораторной практике широко применяют другие готовые аналитические формы — диагностические полоски, изготовлен­ные на принципах «сухой химии». Они предназначены для качес­твенного, полуколичественного и количественного определения биохимических компонентов в биологических жидкостях. В диа­гностических полосках все реагенты в твердой фазе нанесены на подложку в необходимом количестве. Нанесенные на подложку химические реагенты вступают в реакцию с исследуемым вещест­вом в растворителе, которым является биологическая жидкость. Фирмы «Лахема» (Чехия»), «Рош Диагностике», «Мерк» (Герма­ния), «Ames» (США) и др. выпускают экспресс-тесты в виде мо-но- и политестов для исследования в моче рН, кетонов, глюкозы, белка, билирубина, уробилиногена, эритроцитов, гемоглобина, нитратов, удельного веса; в крови — мочевины, глюкозы, псевдо-холинэстеразы. Для количественного определения биохимических показателей с использованием системы «сухой химии» разработа­ны измерительные приборы — специальные фотометры, флюо­ресцентные спектроскопы и др. Так, фирма «Эймс» (США) вы­пускает комплект «Серолайзер», позволяющий определять в кро­ви (сыворотке) гемоглобин и некоторые другие показатели. Фирмой «Рош Диагностике» (Швейцария) разработаны отража­тельные фотометры и диагностические полоски для определения различных показателей крови. Например, система «Рефлотест» поз­воляет определять в субстратах количество глюкозы, мочевины, би­лирубина и его фракций, креатинина, белка, триглицеридов, холес­терина, альбумина, активность АлАТ, АсАТ, ЛДГ, КК, гамма-ГТ, липазы, щелочной фосфатазы, ионов (фосфора, кальция, аммиака), а также некоторых лекарств (фенобарбитала, теофиллина и др.).

В качестве диагностических полосок применяют многослойные пленки, в которых в качестве подложки используют негнущийся пластик или другой подобный материал. Многослойные пленки, объединенные в слайд, были впервые разработаны фирмой «Кодак» (США). Система «Кодак Эктахем» объединяет слайды и прибор, позволяющие определять в сыворотке крови более 20 биохимиче­ских компонентов. Фирма «Optho-Clinical Diagnostics France* (США) выпускает систему «VITROS» для экспресс-диагностики электролитов, ферментов, липидов и иммунодиагностических ис­следований в моче и сыворотке крови.

Для количественного определения веществ с низкой молеку­лярной массой (дигостин, фенитоин, фенобарбитал) используют иммуноферментный тест на основе конкуренции.

Недостатками систем «сухой химии» являются высокая стои­мость анализа, зависимость выбора метода от производителя, воз­можность интерференции лекарств.

Источник: 27.

3.2. МЕТОДЫ ОБЩЕГО КЛИНИЧЕСКОГО АНАЛИЗА КРОВИ

К методам общего клинического гематологического анализа от­носят подсчет количества эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, дифференциальный подсчет лейкоцитов, определение гематокри-та, гемоглобина, осмотической резистентности эритроцитов, вре­мени свертывания крови, времени рекальцинации плазмы, скоро­сти оседания эритроцитов (СОЭ), длительности кровотечения и некоторые другие. Анализы выполняют известными (рутинными) методами или используют автоанализаторы.

Подсчет эритроцитов в камере Горяева. Принцип. Точное количество крови равномерно смешивают в определенном коли­честве жидкости и помещают в камеру с известным объемом, в ко­тором взвесь крови распределяется одним слоем. Дно камеры раз­графлено, благодаря чему возможен точный подсчет эритроцитов.

Реактивы: 0,9%-ный раствор натрия хлорида.

Специальное оборудование: микроскоп, камера Горя­ева, пробирки лабораторные или капилляр от гемометра Сали.

Ход определения. В сухую чистую пробирку вносят 8 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и капиллярной пипеткой 0,02 мл крови. Предварительно кончик пипетки вытирают, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку тщательно промывают верхним слоем жидкости. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Полу­чают разведение крови 1 : 400, т. е. кровь разбавляют в 400 раз. При сгущении крови ее целесообразно разбавить в 500, 600, 700, 800 раз.

Камера и покровное стекло должно быть вымыты и насухо вы­терты. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появи­лись радужные кольца. Берут каплю разведенной крови из пробир­ки и заполняют ею камеру, нанося к краю покровного стекла. Эритроциты подсчитывают через 1 мин после заполнения камеры под малым увеличением микроскопа (объектив х8, окуляр хЮ или х15) с прикрытой диафрагмой или опущенным конденсатором (в затемненном поле зрения). Эритроциты подсчитывают в пяти больших (или 80 малых) квадратах, расположенных по диагонали. Учитывают эритроциты, лежащие внутри малого квадрата, а также на левой и верхней его стенках. Клетки, находящиеся на правой и нижней линиях квадрата, не считают.

Расчет. Подсчитанное число клеток в 80 малых квадратах ум­ножают на 20 000 при разведении крови 1 : 400, на 25 000 при раз­ведении 1 : 500 или на 30 000 при разведении 1 : 600 и получают окончательный результат в миллионах в 1 мкл. При этом исходят из того, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество эритроцитов в 1 мкл еще умно­жают на 1 000 000 (10¹²/л).

Примечание. Не допускается исследование крови со сгустками;

подсчет клеток тотчас после заполнения камеры (не выжидая 1 мин); использование плохо вымы­тых и просушенных пипеток и пробирок, недоб­рокачественных реактивов, вызывающих гемолиз. При соблюдении всех правил подсчета ошибка со­ставит в среднем +2,5 %. Подсчет лейкоцитов в камере Горяева. Принцип. Количес­тво лейкоцитов подсчитывают в определенном объеме камеры с из­вестным разведением крови.

Реактивы: 3%-ный раствор уксусной кислоты, подкрашен­ный метиленовым синим или генцианом фиолетовым из расчета 1 мл 1%-ного водного раствора красителя на 100 мл уксусной кис­лоты.

Оборудование: микроскоп, камера Горяева,. пробирки, микропипетки или капилляр от гемометра Сали.

Ход определения. От каждого животного целесообразно готовить 2—3 образца разведенной крови. В пробирку вносят 0,4 мл 3 или 5 %-ного раствора уксусной кислоты, подкрашенного метиленовым синим (жидкость Тюрка). Капиллярной пипеткой набирают 0,02 мл крови, конец пипетки тщательно протирают вна­чале увлажненной, а затем сухой ватой или марлей. Переносят кровь в пробирку, осторожно выдувая. Пипетку ополаскивают жидкостью Тюрка. Кровь в пробирке тщательно перемешивают, закрывают и оставляют стоять на 4 мин, периодически перемеши­вая содержимое.

Счетную камеру предварительно тщательно обезжиривают спиртом, промывают дистиллированной водой и высушивают под феном, протирают мягкой фланелью. Чистое сухое покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные коль­ца. Кровь в пробирке снова перемешивают стеклянной палочкой, берут каплю крови и наносят к краю покровного стекла камеры. Подсчитывают лейкоциты через 1 мин после заполнения камеры, когда осядут клетки крови, пользуясь малым увеличением микро­скопа (объектив х8, окуляр х10) при затемненном поле, для чего опускают конденсор или суживают диафрагму.

Подсчитывают лейкоциты в 100 больших (1600 малых) квадратах.

Расчет. Подсчитанное в 100 больших квадратах число клеток умножают на 50 (разведение крови 1 : 20), получают окончатель­ный результат в тысячах в 1 мкл. Для подсчета клеток в 1 л коли­чество лейкоцитов в 1 мкл умножают на 1000 (10⁹/л).

При подсчете лейкоцитов в камере соблюдают все те же прави­ла, которые изложены в методике подсчета эритроцитов. Ошибка при подсчете составляет в среднем +7 %.

Наиболее вероятные источники ошибок — травмирование тка­ней ушной раковины при выжимании, выдавливании крови; не­равномерное перемешивание крови; не очень чистый микрокапил-

4 — 4196

49

ляр и др. Каждый лабораторный работник должен выявить собс­твенную ошибку путем многократных анализов одной и той же пробы, включая взятие крови.

Клиническое значение определения в крови эритроцитов и лейкоцитов. Родоначальной клеткой для всех форменных элементов крови является стволовая клетка, кото­рая дает начало общей клетке — предшественника миелопоэза и об­щей клетке — предшественника лимфопоэза. Из клетки — предшес­твенника миелопоэза в миелоидной системе (костный мозг), про­ходя определенные стадии дифференцировки, образуются эритроциты, тромбоциты, моноциты и зернистые лейкоциты. Из клетки — предшественника лимфопоэза в лимфоидной системе образуются лимфоциты: Т-лимфоциты — клетки, обеспечивающие реакции клеточного иммунитета и В-лимфоциты — клетки, обес­печивающие реакции гуморального иммунитета.

Кровь здоровых животных содержит зрелые клетки: эритроци­ты, тромбоциты, лейкоциты (базофилы, эозинофилы, палочко-ядерные и сегментоядерные нейтрофилы, лимфоциты, моноциты) и тучные клетки (цвет. рис. I—VII). Появление незрелых промежу­точных клеток миелопоэза (ретикулоцитов, нормоцитов, эритро-бластов, миелобластов, миелоцитов и др.) и лимфопоэза (плазмо-бластов, пролимфоцитов, лимфобластов и др.) свидетельствует о развитии патологии кроветворения.

Эритроциты — мелкие клетки крови, содержащие гемоглобин, благодаря чему способны переносить кислород от легких к тканям и углекислый газ от тканей к легким. Зрелые эритроциты млеко­питающих — безъядерные клетки, имеют форму двояковогнутого диска. Эритроциты птиц и низших позвоночных — ядерные клет­ки элипсовидной формы.

В нефиксированном (нативном) препарате эритроциты выгля­дят как желтоватые округлые образования. В фиксированных и ок­рашенных мазках крови они обнаруживаются как круглые клетки розового или серовато-розового цвета с просветлением в центре.

Тромбоциты — кровяные пластинки. Это мелкие, безъядерные клетки крови диаметром 5 мкм в количестве от 200 до 900 тыс/мкл, участвуют в свертывании крови. В окрашенных мазках крови они вы­глядят как мелкие круглые или овальные образования. При сниже­нии их числа наблюдается кровоточивость, развивается гемофилия.

Лейкоциты — разнообразные по морфологическим признакам и функциям клетки сосудистой системы крови. Они выполняют функции защиты организма путем фагоцитарной активности и участия в формировании гуморального иммунитета, в восстанови­тельном процессе при тканевом повреждении. Лейкоциты, в ци­топлазме которых содержится специфическая зернистость, назы­ваются зернистыми, или гранулоцитами. К ним относятся нейтро­филы (палочкоядерные, сегментоядерные и юные), эозинофилы и базофилы. Незернистые лейкоциты (агранулоциты) характеризу-

ются отсутствием специфической зернистости в цитоплазме и несегментированными ядрами. В группе агранулоцитов выделяют два вида — лимфоциты и моноциты.

Содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов у взрослых животных в норме приведено в таблице 4.