33. Разведения натрия пирувата для построения калибровочного графика

про­бирки	Рабочий ка­либровочный раствор натрия пирувата, мл	0,03 моль/л раствор пиро-фосфата, мл	Бидистил-лирован-ная вода, мл	Содержание пирови­ноградной кислоты в калибровочной пробе			Активность лдг, нмоль/с ■ л
				мкг	мкмоль
1	0,1	0,8	0,5	0,88	0,01	334
2	0,2	0,8	0,4	1,76	0,02	668
3	0,4	0,8	0,2	3,52	0,04	1336
4	0,6	0,8	—	5,28	0,06	2004
5	0,8	0,6	—	7,04	0,08	2672

Затем в пробирки приливают по 0,5 мл раствора 2,4-динитро­фенилгидрозина. Далее калибровочные пробы обрабатывают и из­меряют, как опытные. Холостую пробу ставят так же, как калиб­ровочную, но вместо калибровочного раствора добавляют дистил­лированную воду. Пересчет активности ЛДГ на микромоли пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 "С проводят по формуле

х= С-30 -4/88,

где х — активность ЛДГ, нмоль/с • л; С — микрограммы пировиноградной кислоты в калибровочной пробе; 30 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 4 — коэффициент пересчета на 1 ч инкубации; 88 — масса 1 мкмоля пировиноградной кислоты, мкг.

Прямолинейная зависимость между концентрацией пировиног­радной кислоты и оптической плотности сохраняется от 0 до 10 ммоль ч/мл. Линейная зависимость между концентрацией на­трия пирувата и оптической плотностью сохраняется от 0 до 3000 нмоль/с • л.

Примечания. 1. Сыворотка крови должна быть свободной от ге­молиза. 2. Для исследования рекомендуется ис­пользовать свежую сыворотку. 3. В качестве анти­коагулянта не следует использовать соли щавеле­вой кислоты, так как они ингибируют фермент. 4. В сыворотке активность ЛДГ на 40 % выше, чем в плазме. 5. Сыворотку хранят при комнатной тем­пературе не более 7 дней в закрытых пробирках.

Хранение сыворотки при температуре от +4 до —20 "С делает ее непригодной для анализа.

Разделение изоферментов ЛДГ проводят электрофоретическим методом на пленках из ацетата целлюлозы.

Источник: 29.

Клиническое значение. ЛДГ ускоряет реакцию окисле­ния молочной кислоты в пировиноградную. Нормальная величина ЛДГ от 0,6 до 4,5 микромолей пировиноградной кислоты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 "С, или 160—1200 нмоль/с-л. Повышение активности ЛДГ отмечают при поражении миокарда, печени и почек, причем при болезнях сердца преимущественно повышается активность изоферментов ЛДГ] и ЛДГ₂, а при парен­химатозных гепатитах и нефритах — изофермента ЛДГ5. У ново­рожденных животных активность ЛДГ выше, чем у взрослых.

Незначительное повышение активности ЛДГ отмечают при ане­миях, физиологическом напряжении, отравлениях, тиреотоксико­зе, злокачественных опухолях. Все заболевания, при которых отме­чается некроз тканей, сопровождаются повышением активности ЛДГ. Увеличение активности изофермента ЛДГ] характерно для поражения сердца. При болезнях печени преимущественно увели­чивается активность изоферментов ЛДГ5 и ЛДГ4 и уменьшается активность ЛДГ] и ЛДГ₂.

Определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке кро­ви по гидролизу В-глицерофосфата (метод Бодански). Принцип. Под действием фермента сыворотки крови натрия В-глицерофос-фат подвергается гидролизу с освобождением неорганического фосфора. По его количеству определяют активность фермента.

Реактивы: глицерофосфатный субстрат, рН 9,0 ± 0,1. 2,15 г натрия В-глицерофосфата и 2,12 г 5,5-диэтилбарбитуровой кисло­ты натриевой соли (мединал) растворяют в дистиллированной воде и доводят объем в мерной колбе на 500 мл до метки. Определяют рН буферного раствора. Хранят в холодильнике под слоем толуола 7—10 дней;

10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

серная кислота концентрированная (плотность 1,84);

раствор аммония молибдата (ч. д. а.). 100 г вещества растворяют в 500 мл воды, подогретой до 50 °С. После охлаждения приливают 100 мл концентрированной серной кислоты, снова охлаждают и переносят в мерную колбу на 1 л, доливают дистиллированной во­дой до метки;

раствор аммония ванадата (ч. д. а.). 2,5 г вещества растворяют в 500 мл кипящей дистиллированной воды. Кипячение продолжают до тех пор, пока раствор не окрасится в желтый цвет. После охлаж­дения раствор переносят в мерную колбу на 1 л и доводят объем дистиллированной водой до метки;

реактив на фосфор. Смешивают растворы аммония молибдата и ванадата в равных объемах. Реактив годен 2 мес;

стандартный раствор фосфора основной. 0,439 г калия фосфата однозамещенного (х. ч.), высушенного над концентрированной серной кислотой, растворяют в 100 мл дистиллированной воды. В 1 мл раствора содержится 1 мг фосфора. Из него готовят рабочий стандартный раствор. Берут 5 мл основного раствора и доводят объ­ем дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл до метки.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; экси­катор; электроплитка.

Ход определения. В центрифужные пробирки вносят по 2,5 мл Р-глицерофосфатного субстрата и ставят в термостат при 37 "С на 15 мин. На каждую пробу берут 2 пробирки (№ 1 и 2) и на серию исследований 2 пробирки на контроль (№ 3 и 4) и 2 про­бирки на субстрат (№ 5 и 6). Через 15 мин в пробирку № 1 добавляют 0,5 мл сыворотки и продолжают нагревать все пробирки в термостате при 37 "С в течение 1 ч (точно). Пробы охлаждают. В пробирку № 2 вносят 0,5 мл сыворотки, в № 3 и 4 — по 0,5 мл дистиллированной воды, в № 5 и 6 — по 0,5 мл рабочего стандартного раствора фосфора.

Во все пробирки вносят по 2 мл 10%-ного раствора трихлорук­сусной кислоты, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 15 мин при 3000 мин^-1. Затем берут 2,5 мл надосадочной жидкости, добавляют 2,5 мл реактива на фос­фор, перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять 2 ч. Центрифугируют 5 мин при 3000 мин^-1.

Фотометрируют пробы и стандарт при длине волны 436 нм (фи­олетовый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против кон­троля. Контроль ставят так же, как опыт, но вместо центрифугата берут 2,5 мл ТХУ и 2 мл дистиллированной воды.

Расчет ведут по формулам

х_{ = А\/В • 5 и х₂ = Ail В ■ 5,

где Xi — количество неорганического фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки крови после ее инкубации, мг; X2 — количество неорганического фосфора, содержащегося в 100 мл сыворотки крови до инкубации, мг; А[ — оптическая плотность исследуемой пробы после инкубации; Л₂ ^— оптическая плотность испытуемой пробы до инкубации; В — оптическая плотность рабочего стандартного раствора фосфора; 5 — коэффициент (для 5 мг%-ного стандартного раствора фосфора).

Разница в содержании неорганического фосфора до и после ин­кубации условно обозначается единицами Бодански. По СИ ак­тивность фермента выражают в микромолях неорганического фос­фора на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации при 37 "С.

₌ а ■ 1000 ■ 4 х ₃₁ ,

где х — активность фермента; а — количество неорганического фосфора, найденное по калибровочному графику, мг; 1000 — пересчет неорганического фосфора в мг; 4 — коэффициент пересчета на 1 мл сыворотки; 31 — масса 1 мкмоля неорганического фосфора, мг.

Примечание. Сыворотка не должна быть гемолизированной.

Клиническое значение. Щелочная фосфатаза так же, как и кислая фосфатаза, отщепляет остаток фосфорной кислоты от ее органических эфирных соединений. В сыворотке крови может быть фермент из костной ткани, печени, желчных путей, кишечника и других тканей. В норме активность щелочной фосфатазы в сыво­ротке крови равна 1,2—5 ед. Бодански или около 0,4—1,4 мкмоль/мл за 1 ч инкубации при 37 "С, или 110—390 нмоль/с • л.

Щелочная фосфатаза не является строго органоспецифическим ферментом. Значительное повышение ее активности отмечают при холангитах, холецистите, желчекаменной болезни, рахите, остео-дистрофии. Несущественные изменения находят при гепатитах, злокачественных новообразованиях, циррозе печени.

Источники: 29, 39.

Примечания. 1. Есть унифицированный метод определения ще­лочной фосфатазы в сыворотке крови по гидроли­зу w-нитрофенилфосфата по Бессея—Лоури. Для определения активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови по Бадански изготовляются на­боры реактивов. 2. В герметически закрытой про­бирке сыворотку можно хранить 7 дней при комнат­ной температуре. 3. Умеренный и сильный гемолиз, липемия, билирубинемия завышают результаты. В плазме активность выше, чем в сыворотке. Определение активности а-амилазы в сыворотке крови, моче, ду­оденальном содержимом амилоклассическим методом со стойким крахмальным субстратом (метод Каравея). Принцип, а-амилаза гидролизует расщепление крахмала с образованием конечных про­дуктов, не дающих цветной реакции с йодом. Об активности а-амилазы судят по уменьшению интенсивности окраски концен­трации крахмала.

Реактивы: бензойная кислота (ч. д. а. или х. ч.); натрия фосфат двузамещенный безводный (NaHP04, ч. д. а.); крахмал растворимый для нефелометрии или крахмал по Lintner. Крахмал по Lintner выпускают зарубежные фирмы специ­ально для использования в качестве субстрата при определении а-амилазы;

154 ммоль/л раствор натрия хлорида;

субстратно-буферный раствор рН 7. 13,3 г безводного двузаме-щенного натрия фосфата и 2,0 г бензойной кислоты растворяют в 250 мл 154 ммоль/л раствора натрия хлорида и доводят до кипения. Суспендируют 0,2 г растворимого крахмала (крахмал для колори­метрии) в небольшом количестве холодной воды и вводят в кипя­щий буферный раствор. Кипятят 1 мин, охлаждают и доводят объ­ем дистиллированной водой до 500 мл. Стабилен при комнатной температуре в течение 10—12 дней. Субстратно-буферный раствор должен быть прозрачным;

калия йодид (ч. д. а. или х. ч.);

калия фторид (ч. д. а.);

калий йодноватокислый (ч. д. а., х. ч.);

кислота хлористоводородная (НСГ) концентрированная (х. ч.);

0,01 н. раствор йода. 0,036 г калия йодноватокислого и 0,45 г ка­лия йодида растворяют в 40 мл воды и медленно при помешивании добавляют 0,09 мл концентрированной НС1. 5 г калия фторида растворяют в 50 мл воды, фильтруют в мерную колбу, приливают 40 мл раствора йода и доливают водой до 100 мл. Хранят в посуде из темного стекла. Годен в течение 1 мес. Если в рабочий раствор йода не добавляют калия фторид, то его необходимо готовить еже­дневно.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; про­бирки, пипетки; мерные колбы; секундомер.

Материал для исследования: светлая сыворотка или плазма крови; моча; дуоденальное содержимое, предварительно разбавленное 154 ммоль/л раствором натрия хлорида.

Ход определения. 5 мл субстратно-буферного раствора вносят в колбу на 50 мл, нагревают 5 мин при 37 °С, добавляют 0,1 мл сыворотки, профильтрованной мочи или дуоденального со­держимого (предварительно разведенного 154 ммоль/л раствором натрия хлорида в 100 раз). Инкубируют 7,5 мин при 37 °С. Время инкубации следует строго отсчитывать по секундомеру с момента добавления биологической жидкости в крахмальный субстрат. Тот­час же после инкубации добавляют 5 мл 0,1 н. раствора йода и до­водят объем дистиллированной водой до 50 мл. Измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 630—690 нм (крас­ный светофильтр) против воды.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но биологическую жидкость добавляют после инкубации вместе с 0,1 н. раствором йода. Измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу, против воды.

Расчет активности гх-амилазы выражают в мг или г крахмала, гидролизованного 1 л биологической жидкости за 1 с инкубации при 37 °С.

Расчет ведут по формулам

х= elzhctKwm

где х — активность а-амилазы, мг/с • л; Е\ — экстинкция холостой пробы; Е^ — экстинкция опытной пробы; С — количество крахмала, введенного в опытную и холостую пробы (2 мг); / (160) — коэффициент пересчета на 1 с инкубации; К — коэффициент пересчета на 1 л биологической жидкости с учетом разведения.

Источник: 43.

Клиническое значение. Фермент амилаза (диастаза) осу­ществляет гидролитическое расщепление полисахаридов до декстри­нов и мальтозы. Богаты амилазой сок поджелудочной железы и слю­на. В кровь фермент поступает главным образом из поджелудочной железы, поэтому активность амилазы в крови и моче повышается обычно при заболевании поджелудочной железы. При остром панк­реатите она повышается в 10 раз и более. Кроме того, амилазная ак­тивность возрастает при перитоните, язвенной болезни свиней, собак и других животных, при заболеваниях почек. Повышение активности амилазы крови, как правило, сопровождается адекватным увеличени­ем ее активности в моче. Однако при нефрозах, гломерулонефритах активность амилазы сыворотки крови увеличена, а в моче снижена.

Снижение активности амилазы в крови и моче наблюдается при гепатитах, дистрофиях печени, сахарном диабете, гипотиреозе, токсической диспепсии.

Нормативы активности а-амилазы в сыворотке крови, моче и других биологических субстратах целесообразно находить на здо­ровых животных-аналогах.

Примечание: Для получения плазмы крови используют только гепарин. Амилаза стабильна в сыворотке и плазме в течение 1 нед при комнатной температуре или при 2—8 "С, при минус 20 "С — 1 год.

Определение активности сорбитолдегидрогеназы (СДГ) в сыво­ротке крови по реакции с резорцином (метод Севела—Товарека). Принцип. D-сорбитол под действием фермента сыворотки в присутствии НАД превращается во фруктозу. При реакции фрук­тозы с резорцином образуется розово-красное окрашивание, ин­тенсивность которого пропорциональна образовавшейся фруктозе,

Реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан;

кислота хлористоводородная (НС1) 0,2 моль/л;

0,5 моль/л раствор D-сорбитола в 0,05 моль/л трис-буфере. 0,225 г D-сорбитола растворяют в 2,5 мл 0,05 моль/л раствора трис-буфера. Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении в холодильнике;

0,05 моль/л трис-буфер, рН 8,8. 70,5 мг трис-(оксиметил)-ами-нометана растворяют в 2,5 мл дистиллированной воды, прибавля­ют 0,4 мл 0,2 моль/л раствора НС1. Доводят рН до 8,8, доливают дистиллированной водой до 10 мл. Раствор стабилен 1 год в случае хранения при комнатной температуре;

0,006 моль/л раствор никотинамидадениннуклеотида (НАД). 25 мг НАД растворяют в 4,5 мл трис-буфера. Раствор стабилен в течение 4 нед при хранении в холодильнике;

100 г/л (10 г/100 мл) раствор трихлоруксусной кислоты;

0,1%-ный раствор резорцина в 96%-ном этиловом спирте;

30%-ный раствор хлористоводородной кислоты (HQ);

0,2 моль/л раствор хлористоводородной кислоты (HQ);

154 ммоль/л раствор натрия хлорида;

калибровочный раствор фруктозы. 27 мг D-фруктозы растворя­ют в небольшом количестве 154 ммоль/л раствора натрия хлорида, переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки 154 ммоль/л раствором натрия хлорида.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; термостат; колбы мерные; секундомер.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,1 мл 0,5 моль/л раствора D-сорбитола и 0,3 мл сыворотки, про­гревают 5 мин при 37 "С, затем добавляют 0,2 мл 0,006 моль/л рас­твора НАД, предварительно прогретого при 37 °С и инкубируют 30 мин при 37 °С. Инкубацию прерывают добавлением 0,4 мл 10 г/100 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости, 0,5 мл раствора резорцина, 1,5 мл 30%-ного раствора НС1, перемешивают и помещают в водяную баню при 80 "С точно на 8 мин, охлаждают. Возникающее розово-красное окрашивание измеряют на ФЭКе при длине волны 500—600 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против холостой пробы.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но раствор трихлоруксусной кислоты добавляют до инкубации.

Расчет активности фермента производят по калибровочному графику. Активность СДГ выражают в микромолях фруктозы, об­разовавшейся при инкубации 1 мл сыворотки в течение 1 ч при 37 "С, или в нмолях фруктозы, образовавшейся при инкубации 1 л сыворотки в течение 1 с при 37 °С. Для перевода мкмолей (ч. мл) в нмоль/с *л найденную величину умножают на коэффициент 16,67.

Д ля построения калибровочного графика из калибровочного раствора D-фруктозы готовят ряд разведений с добавлением реак­тивов, как указано в таблице 34.

Далее калибровочные пробы помещают в водяную баню при 80 °С на 8 мин, охлаждают и измеряют при тех же условиях, что и опытные пробы, против холостой пробы. В холостую пробу вместо калибровочного раствора добавляют 154 ммоль/л раствор натрия хлорида.

Пересчет активности сорбитолдегидрогеназы на микромоли фрук­тозы на 1 л сыворотки за 1 с инкубации при 37 "С производят по фор­муле

С- 1000-3300-2 180-3600

где х — активность сорбитолдегидрогеназы, нмоль/ с^-л; С-1000 — количество D-фруктозы в калибровочной пробе, нм; 3300 — коэффициент пересчета на 1 л сыворотки; 2/3600 — коэффициент пересчета на 1 с инкубации; 180 — масса 1 ммоля D-фруктозы, мкг.

Линейная зависимость сохраняется от 0 до 830 нмоль/с • л.

Примечания. 1. Сыворотка должна быть свежей и свободной от гемолиза. 2. Фермент сыворотки термостабилен. Чтобы избежать потери активности фермента, сы­воротку рекомендуется хранить при температуре 2-8 °С.

Источник: 43.

Для определения СДГ в сыворотке крови имеется набор реак­тивов заводского изготовления, в основу которого положен изло­женный выше метод.

Клиническое значение. СДГ содержится главным обра­зом в клетках печени. У здоровых животных ее активность в крови не определяется из-за небольшой чувствительности методов. По­вышение активности СДГ в сыворотке крови устанавливают при остром гепатите, токсической гепатодистрофии, при обострении хронического гепатита, синдроме цитолиза гепатоцитов.

Определение активности креатинкиназы (КК) в сыворотке (плаз­ме) крови с использованием креатинфосфата в качестве субстрата. Принцип. Активность фермента пропорциональна количеству креатина, образующегося в результате ферментационной реакции. Креатин определяется по цветной реакции с а-нафтолом.

Реактивы: трис-(оксиметил)-аминометан (трис, х. ч.);

магния сульфат (ч. д. а.);

трис-буфер, 0,1 моль/л, рН 7,4, содержащий 0,015 моль/л Mg²⁺ (в виде MgSO^). 1.2 г триса и 0,180 г MgSO^ помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают водой до метки. Раствор стабилен в те­чение 1 мес при хранении в холодильнике;

0,012 моль/л раствор креатинфосфата динатриевой соли, рН 7,4. Растворяют 0,044 г креатинфосфата в 10 мл воды. Раствор стабилен 1 нед при хранении в холодильнике;

0,004 моль/л раствор аденазин-5-дифосфорной кислоты натри­евой соли, рН 7,4. 0,017 г аденозиндифосфата натрия (мол. масса

449) растворяют в 100 мл воды. Раствор стабилен 1 нед при хране­нии в холодильнике;

50 г/л раствор бария гидроксида восьмиводного (ч. д. а. или х. ч.). 5 г безводного бария гидроксида или 8 г восьмиводного ба­рия гидроксида помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают объем до метки водой, не содержащей С0₂;

50 г/л раствор цинка сульфата (ч. д. а., х. ч.). 5 г цинка сульфата помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой, не содержащей С0₂;

а-нафтол (1-нафтол, ч. д. а.);

натрия карбонат (ч. д. а.);

натрия гидроксид (ч. д. а.);

10 г/л раствор а-нафтола. 1 г а-нафтола, 16 г натрия карбоната и 6 г натрия гидроксида помещают в мерную колбу на 100 мл и до­водят до метки водой. Раствор готовят не ранее чем за 2 ч до ис­пользования;

основной раствор диацетила в этиловом спирте. 0,2 мл диаце-тила растворяют в 20 мл этилового спирта;

рабочий 0,5 г/л раствор диацетила. К 1 мл основного раствора приливают 20 мл дистиллированной воды. Реактив хранят в холо­дильнике;

основной калибровочный раствор креатина. 0,131 г креатина помещают в мерную колбу на 100 мл и доливают водой до метки;

рабочий калибровочный 150 мкмоль/л раствор креатина. 1,5 мл основного раствора креатина помещают в мерную колбу на 100 мл и доводят объем водой до метки. Раствор хранят в холодильнике.

Оборудование: спектрофотометр или фотоэлектроколори-метр; мерные колбы; термостат; секундомер.

Ход определения. 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора креатин­фосфата, 0,1 мл сыворотки крови нагревают 5 мин при 37 "С. До­бавляют 0,3 мл раствора натрия аденозиндифосфата и инкубируют 30 мин при 37 °С. После инкубации добавляют по 0,5 мл растворов бария гидроксида и цинка сульфата, центрифугируют 15 мин при 3000—4000 мин^-1. К 1 мл центрифугата добавляют I мл воды, 1 мл раствора а-нафтола, 0,5 мл раствора диацетила. Для развития ок­раски пробу помещают в термостат на 30 мин. Измеряют при 520 нм (зеленый светофильтр).

Холостую пробу ставят так же, как и опытную, но вместо рас­твора аденозиндифосфата натрия добавляют воду.

Для калибровочной пробы 0,3 мл буфера, 0,3 мл раствора аде­нозиндифосфата, 0,4 мл рабочего раствора креатина обрабатывают так же, как опытную пробу. Измеряют против холостой пробы. Хо­лостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо креатина бе­рут воду.

Расчет производят по формуле

^х ~ (^Еоп ~ ^хол)/(-^£1с ^_ ^хол) ' 333,

где х — активность креатинкиназы, нмоль/с • л; Е_оп — экстинкция опытной пробы; Еход — экстинкция холостой пробы; — экстинкция калибровочной пробы; 333 — коэффициент пересчета креатинфосфата, преформированного 1 л сыворотки за 1 с на наномоли.

Примечания. 1. Берут свежую свободную от гемолиза кровь или плазму с ЭДТА или гепарином. Образцы крови в лабораторию доставляют как можно скорее. Сы­воротку хранят в закрытых пробирках в темноте в течение 2 дней при температуре не выше 20—25 "С. 2. Определение активности креатинки­назы в сыворотке крови можно проводить унифи­цированным методом с использованием креатина в качестве субстрата.

Источники: 43, 69.

Клиническое значение. КК катализирует обратимую ре­акцию фосфорилирования креатина. Повышение активности КК отмечается при повреждении сердечной или скелетных мышц. При повреждении сердечной мышцы ее активность у человека по­вышается в 20—30 раз по сравнению с нормой, при повреждении скелетных — еще больше.

При определении активности КК в сыворотке крови животных следует сравнивать величины у клинически здоровых и больных животных. Резкое повышение КК очевидно при миоглобинурии, травматическом перикардите, хирургических заболеваниях (трав­мах). У новорожденных активность КК выше, чем у взрослых.

Определение активности холинэстеразы в сыворотке крови по гидролизу ацетилхолинхлорида. Принцип. Под действием холин­эстеразы происходит гидролиз ацетилхолинхлорида с образованием уксусной кислоты и холина. Уксусная кислота сдвигает рН буфер­ного раствора, что устанавливается с помощью индикатора по из­менению цвета буферного раствора.

Реактивы: 0,9 моль/л раствор ацетилхолинхлорида. 1,63 г ацетилхолинхлорида растворяют в 10 мл дистиллированной воды. При использовании фармакопейного ампулированного препарата содержимое одной ампулы (0,2 г) растворяют в 1,2 мл воды. Рас­твор хранят в холодильнике. Годен в течение 6—7 дней (из-за гиг­роскопичности открытую склянку с ацетилхолинхлоридом хранят в эксикаторе);

вероналовый буфер, рН 8,4. 1,5450 г натриевой соли веронала (мединала) растворяют в 500 мл дистиллированной воды, добавля­ют 9 мл 0,1 моль/л раствора соляной кислоты и 150 мл 0,1 г/л рас­твора индикатора, измеряют рН. Объем доводят дистиллирован­ной водой до 1 л. Буфер хранят в холодильнике в посуде из темно­го стекла. Годен в течение 1 мес;

индикатор — фиолетовый синий с переходом окраски от жел­той к красной в пределах рН 6,8—8,4. 0,1 г сухого индикатора рас­тирают в ступке с 5,7 мл 0,05 моль/л раствора натрия гидроксида. После растворения объем доводят дистиллированной водой до

25 мл. Из полученного 0,4%-ного раствора перед употреблением готовят 0,01%-ный раствор разведением его дистиллированной во­дой в 40 раз;

0,7%-ный водный раствор прозерина. 0,7 г прозерина растворя­ют в 100 мл дистиллированной воды. Хранят в посуде из темного стекла;

0,1 моль/л раствор уксусной кислоты. Готовят из стандарт-тит­ра (фиксанала) или путем доведения дистиллированной водой 5,7 мл ледяной уксусной кислоты (х. ч.) до 1000 мл в мерной колбе на 1 л.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; уль­тратермостат; мерные колбы.

Ход определения. В пробирку вносят 5 мл вероналового буфера, 0,2 мл дистиллированной воды и 0,1 мл сыворотки. Смесь прогревают при температуре 37 °С в течение 5 мин. Затем добавля­ют 0,2 мл раствора ацетилхолинхлорида и инкубируют в течение 30 мин при температуре 37 °С. После инкубации добавляют 0,2 мл раствора прозерина. Экстинкцию измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 500—560 нм (зеленый све­тофильтр) против воды. Окраска устойчива в течение 1 ч.

Контроль ставят так же, как опыт, но раствор прозерина добав­ляют до инкубации.

Из экстинкции контрольной (холостой) пробы вычитают экс­тинкцию опытной. Расчет ведут по калибровочному графику. Ак­тивность холинэстеразы выражают в микромолях уксусной кисло­ты на 1 мл сыворотки за 1 ч инкубации или в нмоль/с • л. В этом случае полученную величину умножают на коэффициент 0,280.

Для построения калибровочного графика из 0,1 моль/л раствора уксусной кислоты готовят разведения, как указано в таблице 35.

И з каждого разведенного раствора отбирают по 0,2 мл, добав­ляют 5 мл вероналового буфера и 0,1 мл сыворотки, прогревают 5 мин при температуре 37 "С, добавляют 0,2 мл раствора прозери­на, 0,2 мл ацетилхолинхлорида. Смесь инкубируют 30 мин при температуре 37 "С, быстро охлаждают. Экстинкцию измеряют при тех же условиях, что и в опытных пробах. Холостую пробу ставят так же, как калибровочную, но вместо стандартных растворов ис­пользуют дистиллированную воду. Из экстинкции холостой пробы вычитают экстинкцию калибровочной пробы. Полученную вели­чину экстинкции откладывают на оси ординат, количество мкмоль уксусной кислоты — на оси абсцисс. Линейная зависимость калиб­ровочного графика сохраняется в пределах от 0 до 110 мкмоль/с • л. Примечания. 1. Активность холинэстеразы заметно не изменяет­ся при хранении сыворотки в герметически за­крытых пробирках в холодильнике при температу­ре 2—6 "С в течение 4 дней. 2. Исследование долж­но проводиться тотчас после доставки образцов крови в лабораторию. 3. Ложноотрицательные результаты вследствие ингибирования активнос­ти холинэстеразы дают цитраты (антикоагулян­ты), оксалаты, фториды. 4. Определение актив­ности холинэстеразы в сыворотке крови возмож­но методом с субстратом бутирилтиохолина йодидом. Источники: 19, 43.

Клиническое значение. Холинэстераза расщепляет аце-тилхолин на холин и уксусную кислоту. Фермент синтезируется в печени, поэтому степень активности холинэстеразы во многом за­висит от функционального состояния этого органа.

У здоровых животных активность холинэстеразы сыворотки крови ориентировочно составляет 150—300 мкмоль/ч ■ мл (42—84 нмоль/с ■ л). Уменьшение активности холинэстеразы от­мечается при хроническом гепатите, циррозе печени, отравле­ниях фосфорорганическими средствами. Активность холинэсте­разы низка у новорожденных животных.

Определение активности уреазы в сое. Реактивы: индикатор феноловый красный. В 10 мл этилового спирта растворяют 50 мг индикатора;

калия фосфат двузамещенный (К2НРО4) и калия фосфат одноза-мещенный (КН2РО4) (ч. д. а., х. ч.) перекристаллизованные;

0,05 н. раствор К2НРО4. 8,7 г вещества растворяют дистиллиро­ванной водой в мерной колбе на 1 л;

0,05 н. раствор КН2РО4. 6,8 г вещества растворяют дистиллиро­ванной водой в мерной колбе на 1 л;

мочевина (карбамид);

эталонные буферные растворы готовят в колбочках с притерты­ми пробками, как указано в таблице 36.

Оборудование: ступка фарфоровая; сито с отверстиями диаметром 0,25 мм; колбочки с притертыми пробками.

Ход определения. Измельчают соевый шрот или зерно сои, просеивают на сите. В каждую из семи пробирок вносят по 10 мл эталонного буферного раствора с соответствующими рН и по 2 капли раствора индикатора. В две параллельные пробирки

вносят по 0,2 г измельченного соевого шрота или соевой муки, по 10 мл буферного раствора № 1 (рН 7,00), по 0,3 г мочевины и по 2 капли раствора индикатора. Пробирки со смесью выдерживают в водяной бане при температуре 20—25 "С в течение 30 мин, пери­одически осторожно встряхивают. Появившуюся в пробирках ок­раску сравнивают с эталонной в семи буферных растворах, находят рН испытуемой пробы.

Активность уреазы определяют по формуле

х = рН| - рН₀,

где х — активность уреазы, рН; рН j — величина рН раствора испытуемого образца; рНо — рН исходного буферного раствора (рН 7,00).

В параллельных пробах корма допускаются расхождения рН не более ±0,05.

Клиническое значение. В соевых кормах, не подверг­шихся соответствующей термической обработке, имеются ингиби­торы трипсина. Поедание таких кормов птицей и свиньями вызы­вает расстройство пищеварения, диарею и другие нежелательные последствия. Поэтому в таких кормах перед их скармливанием оп­ределяют активность уреазы и выражают ее величиной рН. В со­евой муке и шроте для птиц рН должен быть не более 0,1.

Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-глута-милтрансферазы) в сыворотке крови с помощью набора реактивов. Принцип. у-Глутамилтранспептидаза (ГГТ) катализирует реак­цию переноса L-глутаминового остатка с хромогенного субстрата на глицилглицин. При этом высвобождается w-нитроанилин, оп­тическую плотность которого измеряют фотометрически. Актив­ность фермента определяют по приращению оптической плотнос­ти раствора кинетическим методом или методом постоянного вре­мени. Активность фермента наиболее высока в почках, поджелу­дочной железе, печени и предстательной железе.

Реактивы: субстрат 200 мг L-глутамил-и-нитроанилина;

2,47 г буферной смеси (глицилглицин 1,26 г, трис 1,21 г);

3,0 мл стандартного 5 моль/л раствора и-нитроанилина;

дополнительный реактив — 10%-ная уксусная кислота.

Оборудование: фотоэлектроколориметр или спектрофо-к метр, длина волны 400—430 нм.

Приготовление рабочих растворов. 1. Буферный раствор, рН 8,1. 2,47 г буферной смеси растворяют в 70—80 мл дистиллированной воды в мерной колбе на 100 мл и доливают водой до метки. Рас­твор стабилен при хранении в холодильнике. 2. Субстратно-буфер­ный раствор. Отбирают 40 мг субстрата и растворяют в 18 мл дис­тиллированной воды, добавляют 17 мл буферного раствора и дово­дят до температуры 37 °С. Раствор устойчив при 15—25 °С в тече­ние 10 ч.

Ход определения. Кинетический метод. В кювету длиной 1 см, термостатированную при 37 "С, помещают 1,2 мл субстрат­но-буферного раствора, предварительно приведенного к 37 °С. За­тем вводят 0,1 мл сыворотки или плазмы крови, перемешивают и начинают отсчет времени. Измеряют оптическую плотность рас­твора при 400—430 нм (Hg 405 нм) против воды в течение 1—5 мин после старта.

Для калибровочной пробы 0,1 мл стандартного раствора и-нит-роанилина (содержимое ампулы) доводят дистиллированной водой до 5 мл. Измеряют оптическую плотность раствора в условиях, ана­логичных опытной пробе.

Расчет активности у-глутамилтранспептидазы ведут по фор­мулам

х = 21660^ или

х = 77,98-^, А

где х — активность фермента, нмоль/с -л или мкмоль/ч • мл; 21660 — коэффициент для перевода в нмоль/с • л; 77,98 — коэффициент для перевода в мкмоль/ч - л; VA — разность экстинкции опытной пробы в пересчете на 1 мин инкубации; А — экстинкция калибровочной пробы.

Метод постоянного времени. В пробирку вносят 1 мл субстрат­но-буферного раствора, приведенного к температуре 37 "С, и при­ливают 0,1 мл сыворотки или плазмы крови. Содержимое переме­шивают и инкубируют точно 15 мин при 37 °С. Затем добавляют 6 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты и перемешивают.

Холостую пробу ставят так же, как и опытную, но сыворотку добавляют после инкубации.

Измеряют экстинкцию опытной пробы против холостой при длине волны 400—430 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Активность у-глутамилтранспептидазы определяют по калибро­вочному графику. Для построения его из стандартного раствора л-нитроанилина (содержимое ампулы) готовят разведения в соот­ветствии с таблицей 37.

В пробирке отмеривают по 0,1 мл полученных растворов, до­бавляют по 7 мл 10%-ного раствора уксусной кислоты, перемеши­вают и фотометрируют против воды в условиях, аналогичных опытной пробе. Строят график зависимости оптической плотнос­ти раствора от активности фермента.

Линейность калибровочного графика сохраняется до активнос­ти 5000 нмоль/с • л.

Клиническое значение. Активность фермента в сыво­ротке крови повышается при гепатобилиарных заболеваниях, бо­лезнях поджелудочной железы, диабете. Наиболее высокая актив­ность ГГТ (ГГФ) отмечается при закупорке желчных протоков и других холестических состояниях, а также при вовлечении пече­ни в злокачественный процесс, когда без признаков желтухи ак­тивность фермента возрастает в 10—15 раз. При хроническом гепа­тите активность ГГФ повышается в несколько раз. ГГФ особенно чувствительна к гепатотоксическим воздействиям. Определение активности ГГТ (ГГФ) — наиболее чувствительный скрининговый тест на заболевание печени, который предпочтительнее определе­ния трансамиаз или щелочной фосфатазы.

По данным Н. В. Утеченко (2003), активность ГГТ в сыворотке крови телят при токсической гепатодистрофии составляла 1103,0 (+118,4) - 2393,0 (+417) нкат/л при норме 150,0 (+30,0) нкат/л. Примечания. 1. Методика утверждена Минздравом Украины.

Приказ № 91 от 8.04.1998 г. 2. При активности пробы выше 5000 нмоль/с • л ее разбавляют фи­зиологическим раствором (0,9 % натрия хлорида). Результат умножают на разделение. 3. Активность у-глутамилтранспептидазы не изменяется в тече­ние 7 дней при хранении сыворотки крови при 4 °С и в течение 3 мес при минус 20 "С. 4. В случае использования кюветы с рабочим объемом более 1 мл количество рабочего раствора необходимо пропорционально увеличить. 5. Из всех антикоагу­лянтов предпочтение отдается ЭДТА. Калия окса­лат с натрия фторидом снижают активность ГГТ. 6. В сыворотке крови активность ГГТ выше, чем в плазме. 7. Билирубинемия, гемоглобин, липемия дают ложнозаниженные результаты.

3.3.12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ В КОРМАХ, КРОВИ И ДРУГИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ

В связи с неравномерным внесением в почву больших доз азот­ных удобрений возникает возможность накопления в кормах и во­де высоких концентраций нитратного и нитритного азота. При по­едании таких кормов или использовании воды у животных нару­шается обмен веществ, репродуктивная функция и даже возможно отравление.

В системе профилактики нитратного и нитритного токсикоза важное значение имеет систематический контроль за концентра­цией нитратов и нитритов в кормах, воде, крови, молоке и других субстратах.

Для определения нитратного и нитритного азота в почве, кор­мах, воде и биологических субстратах используют фотометриче­ские, ионометрические и другие методы, применяют автоанализа­торы проточного типа.

В ветеринарных и зоотехнических лабораториях для определе­ния нитратов и нитритов в кормах, крови и патологическом мате­риале чаще применяют колориметрический метод с использовани­ем реактива Грисса. В последнее время в агрономии, зоотехнике и ветеринарии широко используют ионометрический экспресс-ме­тод определения нитратного азота в почвах, растениях, кормах, природных водах и биологических субстратах.

Определение нитратов в кормах, крови, молоке и патологическом материале с использованием реактива Грисса. Принцип. Метод основан на извлечении нитратов из проб дистиллированной водой, восстановлении их до нитритов металлическим цинком в растворе уксусной кислоты и взаимодействии последних с реактивом Грис­са с образованием азосоединения розово-красного цвета. Реакция специфична для нитратов. Чувствительность определения 40 мкг нитрат-ионов в пробе.

Реактивы: сульфаниловая кислота (ч. д. а.);

1-нафтиламин (сс-нафтиламин, ч. д. а.);

уксусная кислота концентрированная (х. ч.);

калия нитрат (KNO3, х. ч.);

цинковая пыль;

марганца сульфат (ч. д. а.);

реактив Грисса: а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты; б) 0,1 г а-нафтила-мина растворяют при нагревании в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12%-ного раствора уксусной кислоты. Растворы «а» и «б» хранят отдельно в холодильнике в те­чение 2 мес. Перед употреблением их смешивают 1:1;

калибровочный раствор калия нитрата основной. Растворяют 1,630 г калия нитрата, высушенного до постоянной массы при 105 °С в дистиллированной воде в мерной колбе на 1 л и доводят

объем раствора до метки дистиллированной водой. 1 мл этого рас­твора содержит 1 мг нитрат-ионов (NO3). Хранят в холодильнике в течение 3 мес;

рабочий калибровочный раствор калия нитрата. В мерную кол­бу на 100 мл переносят 20 мл калибровочного раствора калия нит­рата и доводят объем до метки дистиллированной водой. 1 мл это­го раствора содержит 0,2 мг (200 мкг) нитрат-ионов (NO3). Гото­вят перед анализом.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; химические про­бирки; пипетки на 1, 5, 10, 20 мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл; конические колбы; химические стаканы; цилиндры на 10, 50 и 100 мл; мешочки или пленка для диализа.

Ход определения. Для исследования берут 10 г измельчен­ного растительного или патологического материала, такое же ко­личество гепаринизированной крови (молока). Извлечение нитра­тов из проб крови, молока, патологического материала и кормов, дающих при извлечении окрашенные растворы, проводят методом диализа. Для этого измельченные пробы (сухие пробы предвари­тельно смачивают) помещают в мешочки или пленку для диализа и погружают в стаканчики или колбы с 50 мл дистиллированной воды на 2 ч. Затем диализат фильтруют в калиброванный сосуд, а мешочек с пробой еще раз погружают в 20 мл дистиллированной воды на 30 мин в тот же сосуд. Затем мешочки с пробами вынима­ют, диализат фильтруют и объединяют с первым, доводя его объем до 100 мл. 6 мл диализата отбирают в пробирку для анализа на нит­раты. При малом содержании нитратов в пробе диализат концент­рируют до небольшого объема, фильтруют его, измеряют объем и берут 6 мл для анализа.

Для извлечения нитратов из проб растительного материала, образующих неокрашенные растворы, измельченные пробы по­мещают в конические колбы и наливают 50 мл дистиллирован­ной воды. Извлечение проводят 1 ч, часто встряхивая колбы. За­тем раствор фильтруют, пробу еще раз смывают 20—30 мл дис­тиллированной водой и объединяют с первой частью фильтрата, пропуская через тот же фильтр. Далее поступают так же, как описано выше.

В пробирку с 6 мл анализируемого фильтрата приливают 2 мл 10%-ной уксусной кислоты и вносят на кончике скальпеля смесь цинковой пыли с марганца сульфатом (1 г цинковой пыли пред­варительно тщательно перемешивают со 100 г марганца сульфа­та). Пробирку встряхивают 30 с. Затем приливают 1 мл реактива Грисса, перемешивают содержимое пробирки и через 10 мин ко­лориметрируют иа ФЭКе при длине волны 536 нм (зеленый све­тофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против дистиллиро­ванной воды. Оптическую плотность окрашенного раствора оп­ределяют только при наличии прозрачного и бесцветного филь­трата.

Расчет ведут по калибровочной кривой. Для составления шкалы стандартов в 8 химических пробирок наливают рабочий раствор в количестве, указанном в таблице 38.