1.3. Флюориметры (люминометры)

Принцип работы флюориметров основан на измерении величи­ны люминесценции — интенсивности излучения некоторых ве­ществ вследствие возбуждения под действием света определенной длины волны, причем длина волны возбуждающего света всегда короче длины волны света излучаемого. Поэтому для возбуждения в люминометрах используют различные источники ультрафиоле­тового излучения, как правило, достаточно мощные. Свет от ис­точника ультрафиолетового излучения с помощью специальных линз фокусируется на кювете с исследуемым веществом и возбуждает флуоресценцию в растворе, которая с помощью специальных линз фокусируется на фотодетектирующем устройстве. Благодаря работе фотодетектора происходит пропорциональное преобразование свето­вого сигнала в электрический.

В общем случае интенсивность флуоресценции пропорцио­нальна концентрации флуоресцирующего вещества. Однако дан­ное утверждение справедливо лишь для достаточно малых концен­траций. При повышении концентрации флуоресцирующего вещес­тва наблюдается ряд эффектов (реабсорбции и экранирующий), благодаря которым зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации испытывает значительные отклонения от линейнос­ти. В аналитических процедурах с использованием флуориметрии, также как в фотометрии, применяют калибровочные графики, пос­троенные на основании флуориметрии эталонных растворов.

Область применения приборов довольно широкая — от биохи­мических аналитических (витаминов, гормонов, ферментов) до микробиологических (определение концентрации микробных тел, связанных с мечеными флуоресцеином антителами) и иммуноло­гических исследований.

Из представленных на отечественном рынке сравнительно не­дорогих отечественных флуориметров для лабораторных клини­ческих исследований наиболее пригоден анализатор «Флюорат-02» НПП «ДОЗА» модификаций 02-01 и 02-03, работающий в спект­ральном диапазоне 200—600 нм. Его рабочие области задаются све­тофильтрами, позволяющими проводить не только флуоресцент­ный анализ, но и фотометрический, хемилюминесцентный и ана­лиз фосфоресценции.

1.4. ПЛАМЕННЫЕ ФОТОМЕТРЫ

Применяются при количественном элементном анализе. Прин­цип работы пламенных фотометров основан на изучении окраски пламени при внесении в пламя горелки исследуемого вещества в виде аэрозоля. Окраска пламени, точнее, изменение окраски, обусловлена излучением, сопровождающим переход атомов рас­пыленного в пламени вещества из более высокого энергетического состояния в более низкое. Молекулы солей металлов, попадая в пламя, вследствие высокой температуры распадаются на отдель­ные ионы, электроны которых непрерывно переходят из одного энергетического состояния в другое, что сопровождается непре­рывным излучением и поглощением света. Минимальная темпера­тура, необходимая для атомизации и возбуждения, зависит от при­роды исследуемого элемента, но довольно мало от состава соедине­ния, в который этот элемент входит. Поэтому возможности метода пламенной фотометрии ограничиваются возможностями создания пламени высокой температуры. При сгорании бытового газа (ме­тан) в воздухе метод позволяет определять содержание лишь легко­возбудимых щелочных металлов — лития, калия, натрия. При пе­реходе к высокотемпературному пламени, такому, как водород в кислороде или ацетилен в кислороде, возможности метода значи­тельно расширяются.

Современные приборы для пламенной фотометрии оснащены устройствами дозирования и введения исследуемых растворов в пламя горелки; оптической системой, формирующей луч света, па­дающий в приемник; электронными усилителями сигнала; блока­ми индикации или регистрации сигнала; устройствами поджига горелки и др. В некоторых приборах фотоэлектрический сигнал формируется совокупностью устройств таким образом, что его ве­личина становится пропорциональной концентрации исследуемо­го вещества, а шкала прибора градуирована в единицах концент­рации исследуемого вещества.

Наиболее часто в клинических лабораториях пламенную фото­метрию используют для определения содержания калия и натрия, тем более что обычные химические методы определения этих эле­ментов сложны и неточны.

На российском рынке на сегодняшний день представлено зна­чительное количество пламенных фотометров различных фирм. Наиболее оптимален для работы диагностической клинической ла­боратории отечественный ФПА-02, поставляемый с компрессором.

1.5. АТОМНО-АБСОРБЦИОННЫЕ СПЕКТРОФОТОМЕТРЫ

Атомная абсорбциометрия используется для количественного определения содержания металлов в растворах. Принцип работы атомных абсорбциометров основан на поглощении ультрафиолето­вого или видимого излучения атомами газа. Для перевода образца растворенного вещества в газообразное состояние раствор впрыс­кивают в пламя. В качестве источника излучения применяют лам­пу с полым катодом из того же металла, что и определяется в дан­ный момент. Спектральная ширина линии, испускаемой источ­ником света, как и линии поглощения того же самого элемента в пламени, порядка 0,001 нм, поэтому мешающее поглощение дру­гих присутствующих элементов практически исключено.

Температура пламени, как и в случае пламенной фотометрии, определяется горючей газовой смесью. При определении элемен­тов, образующих труднодиссоциирующие соединения (алюминий, бериллий, кремний, ванадий, молибден), используют высокотем­пературное пламя (ацетилен — оксид азота). Для клинической ла­боратории в большинстве случаев достаточно воздушно-пропано-вого пламени.

Фотометры для атомной абсорбции — высокочувствительные приборы, но для каждого определяемого элемента должна быть своя лампа, что конструктивно усложняет прибор.

Как и в пламенном фотометре, в атомно-абсорбционном для распыления используют различные эжекторы. Интенсивность рас­пыления зависит от условий их работы, на что, в свою очередь, влияет вязкость раствора. Поэтому при работе с вязкими, богаты­ми белком жидкостями, такими, как сыворотка крови, разведение должно быть всегда одним и тем же.

Преимущество атомной абсорбциометрии перед традиционны­ми методами анализа проявляется в полной мере в клинической лаборатории при определении таких микроэлементов, как медь, марганец, цинк, а также при токсикологических исследованиях при определении содержания ртути.

Из представленных на рынке атомно-абсорбционных спектро­фотометров можно выделить отечественный «Квант-2А» с пламен­ной атомизацией и его модификации, отличающиеся комплектаци­ей и другими способами атомизации образца, а также «Анали-тик-2000» и «Спираль-17». Однако все приборы весьма дорогие.

1.6. ПОЛЯРИМЕТРЫ

Приборы этой группы применяются для поляриметрического анализа, основанного на измерении угла вращения плоскости поля­ризации луча света, прошедшего через оптически активную среду.

Многие вещества способны изменять плоскость поляризации поляризованного света, причем угол изменения плоскости поля­ризации бывает пропорционален концентрации этого вещества. Поляриметры имеют источник света — поляризатор — прозрачную кристаллическую пластинку, пропускающую свет, поляризован­ный в определенной плоскости; устройство для кювет с анализи­руемым веществом и анализатор — вторую пластинку, пропускаю­щую поляризованный свет, вращая которую можно измерить угол смещения поляризации в луче света, прошедшем через раствор, по отношению к плоскости исходного луча.

Таким образом, свет проходит через светофильтр, пропускаю­щий только узкий диапазон длин волн, конденсор, формирующий луч, поляризатор, кварцевую пластинку, кювету с анализируемым веществом, анализатор, объектив и окуляр и попадает в глаз иссле­дователя. Вращением регулирующего устройства выравнивается освещенность двух (или иногда трех) полей, наблюдаемых иссле­дователем в объективе. Регулирующее устройство имеет градуиров­ку, по которой определяется угол смещения поляризации и в ко­нечном итоге концентрация вещества.

При вращении анализатора в поляриметрах П-161М и П-161 СМ и две наружные части поля освещаются или затемняются в зависимости от угла поворота, а средняя часть поля меняет осве­щенность в обратном порядке. Показания с оптической шкалы ре­гистрируют при положении, когда средняя часть поля затемняется одинаково с крайними, а границы полей исчезают. Определение правовращающих веществ на СМ проводится на шкале 0—35°, а левовращающих — от 360 до 325°, при этом угол вращения опре­деляется как разница между 360° и величиной отсчета по шкале. В автоматических поляриметрах «Р 3002 KRUSS» или «Polartronic N Н8» никакого вращения анализатора не требуется, все результа­ты сразу высвечиваются на шкале дисплея, но стоимость этих при­боров в 10 раз выше.

Особое место занимают специализированные поляриметры — сахариметры, специально предназначенные для определения со­держания Сахаров в различных жидкостях. В лабораторной клини­ческой практике широко применяется для анализа глюкозы в моче поляриметр MP-1010, используемый и для выявления фальсифи­кации меда сахаром при ветеринарно-санитарной экспертизе. Ча­ще всего с этой целью пользуются поляриметрами П-161М и СУ-5.

1.7. РЕФРАКТОМЕТРЫ

Рефрактометры предназначены для определения показателя преломления вещества. В наиболее распространенных среди них (за основу конструкции взяты рефрактометры Аббе и Пульфриха) луч света от зеркала попадает на призму из двух половинок, между которыми помещают слой исследуемого вещества (несколько ка­пель). Поле в окуляре рефрактометра при этом выглядит равно­мерно освещенным. Поворотом призмы достигается полное внут­реннее отражение света от поверхности раздела между нижней по­ловиной призмы и анализируемым веществом, что наблюдается в окуляре появлением темного поля с резко очерченными граница­ми. После этого перекресток нитей в окуляре специальным мик­рометрическим винтом наводят на границу темного поля, делают отсчет значения и по шкале прибора. В зависимости от типа реф­рактометра точность измерения показателя преломления может достигать от 0,0001 до 0,00001.

Рефрактометрический анализ экспериментально довольно прост и широко применяется в технологическом контроле спиртовой и пищевой промышленности для определения содержания сухих ве­ществ в молоке, белков в сыворотке крови при клинических иссле­дованиях, содержания сахара в различных жидкостях. Целесооб­разно применять его для определения одного какого-либо вещества, показатель преломления которого резко отличается от показате­лей преломления остальных присутствующих веществ и среды. При проведении анализов по показателю преломления, пользуясь калибровочным графиком, находят содержание определяемого ве­щества. Некоторые типы промышленных рефрактометров снабже­ны для удобства работы шкалами, показывающими сразу содержа­ние сахара или сухих веществ.,

Часто данные рефрактометрического анализа используют в вете-ринарно-санитарной экспертизе для определения натуральности мо­лока. Метод основан на осаждении белков молока с последующим измерением показателя преломления молочной сыворотки, который зависит от кислотности молока и содержания в нем воды.

Наиболее распространены простые отечественные рефракто­метры РЛ-2, РЛ-2М, РПЛ-ЗМ, а также высокоточные рефракто­метры-интерферометры ИРФ-454 Б2М, ИРФ-456 «Карат-МТ». Для серийных экспресс-анализов часто применяют погружные рефрактометры.

1.8. АНАЛИЗАТОРЫ СОМАТИЧЕСКИХ КЛЕТОК МОЛОКА

В последнее время в лабораториях молочной промышленности получили распространение специализированные приборы контро­ля соматических клеток молока: индикатор подсчета соматических клеток молока (ИСКМ-1) и анализатор соматических клеток мо­лока («СОМАТОС»). Принцип их действия основан на кондукто-метрии — измерениях электропроводности молока на постоянном и переменном токе. Оба прибора практически не требуют предва­рительной подготовки образцов.

1.9. ПРИБОРЫ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Принцип действия физических приборов, используемых в им­мунологии, как правило, базируется на изучении физических ха­рактеристик, образующихся в результате взаимодействия антигена с иммуноглобулинами (и некоторых других реакций) макромоле-кулярных иммунных комплексов. Основной сильно меняющейся в процессе реакции физической характеристикой среды, в кото­рой происходит образование иммунных комплексов, является ее светорассеивающая способность. Поэтому в современном имму-нохимическом анализе большое распространение получили мето­ды турбидиметрического и нефелометрического анализов. Оба ме­тода позволяют количественно судить о мутности раствора: либо по количеству рассеянного света, либо по количеству прошедшего света; в первом случае говорят о нефелометрии, во втором — о турбидиметрии.

Турбидиметрическим методом анализа (турбидиметрией) назы­вают метод, основанный на измерении интенсивности света, про­шедшего через суспензию или эмульсию, т. е. мутную среду. Ин­тенсивность уменьшается вследствие рассеяния света.

Нефелометрическим методом анализа (нефелометрией) называют метод, основанный на измерении интенсивности света, рассеян­ного мутной средой — суспензией или эмульсией. При отсутствии поглощения интенсивность рассеянного света пропорциональна числу дисперсных частиц.

Нефелометрия — более чувствительный и надежный метод, позволяющий работать с очень низкими концентрациями преци­питата. В силу принципа нефелометрии при отсутствии преципи­тата в растворе на фотодетектор свет от источника вовсе не попа­дает и достаточно очень небольшого числа светорассеивающих частиц, чтобы получить резкое возрастание сигнала. Поэтому в настоящее время большое распространение получили сканирую­щие лазерные нефелометры, специализированные для иммуноло­гических целей. Эти приборы позволяют в автоматизированном режиме измерить мутность иммунологической плашки путем пос­ледовательного или параллельного «опроса» состояния содержи­мого всех лунок. «Опросом» и обработкой результатов управляет ПЭВМ. Наличие в качестве источника света лазера в значительной степени упрощает оптическую часть приборов (нет проблем с фоку­сировкой луча) и резко повышает чувствительность системы вследс­твие высокой яркости и отсутствия нагревания раствора лучом.

Турбидиметрические измерения требуют гораздо более высокой концентрации преципитата, так чтобы рассеивалось не менее 20 % падающего света, иначе надежность измерений снижается. С дру­гой стороны, для турбидиметрических измерений не требуется специального прибора, пригоден любой колориметр. Турбидимет­рические измерения ведут на самой короткой длине волны, позво­ляемой конкретным прибором.

1.10. ОСНОВНЫЕ ПРАВИЛА УСТАНОВКИ И ЭКСПЛУАТАЦИИ ПРИБОРОВ

Отечественные лабораторные приборы и оборудование, а также импортные разрешаются к применению в лабораториях клиниче­ской диагностики приказом соответствующего министерства (Минздрав РФ и т. п.), а также Государственным комитетом Рос­сийской Федерации по стандартизации и метрологии (ГОСТ-Р).

В процессе эксплуатации измерительные приборы подлежат го­сударственному метрологическому надзору. Периодический конт­роль измерительной техники проводят путем «поверки» — провер­ки соответствия приборов паспортным метрологическим характе­ристикам по категориям стандартных образцов. Стандартные и контрольные образцы имеют следующие категории:

государственные стандартные образцы (ГСО). Утверждаются Госстандартом России, регистрируются в Государственном реестре средств измерений и служат для работы органов государственных метрологических организаций;

отраслевые образцы (ОСО). Утверждаются ведомственными ор­ганизациями по согласованию с Госстандартом. Их применяют для контроля правильности результатов измерения по всем методикам, кроме методик, регламентированных государственным стандартом и для градуировки средств измерений;

стандартные образцы предприятий (СОП). Утверждаются так же, как ОСО. Используют их для работ по стандартам предприятий.

Средства измерений проверяют только представители метрологи­ческих организаций. Основным документом при этом является тех­ническая эксплуатационная документация, прилагаемая к прибору.

Вновь приобретенный прибор устанавливают представители организации изготовителя, которые проверяют его комплект­ность по техническим условиям, соответствие внешнему виду и наличие внешних систем индикации, регулировки и контроля. Функциональную способность прибора и метрологическую ха­рактеристику выверяют по техническому описанию и стандарт­ным образцам.

Для различных фотометрирующих приборов, у которых метро­логическая характеристика выражена в единицах пропускания или оптической плотности, в качестве стандартных образцов служит набор стандартных светофильтров, физическая характеристика ко­торых соответствует значениям принятой градуировки шкал. Для рН-метров используют стандартные образцы буферных растворов (фиксаналы) с фиксированными значениями рН с точностью до 0,01 и специальные приборы, выдающие точные значения ЭДС. Для рефрактометров используют образцы специальных пластин и жидкостей с известным показателем преломления. Для поляримет­ров в качестве ГСО и ОСО используют образцы пластин с градуи­ровкой поляризации в угловых градусах. Гемоглобинометры, граду­ированные гемиглобинцианидным методом, калибруются стандар­тными растворами гемиглобинцианида в ампулах.

Положительные результаты поверки приборов оформляют сви­детельством (сертификатом) на право дальнейшей эксплуатации.

1.11. ПРАВИЛА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ЭКСПЛУАТАЦИИ ПРИБОРОВ И ОБОРУДОВАНИЯ

Технической документацией, прилагаемой к каждому устрой­ству или прибору, предусмотрены необходимые меры и условия эксплуатации для обеспечения безопасности персонала, обслужи­вающего прибор, экологической безопасности прибора, исключе­ния электромагнитных помех в работе. При работе с электропри­борами наибольшую опасность представляют поражения электри­ческим током. Мерами безопасности в этом случае являются заземление приборов и строгое соблюдение инструкции, прилага­емой к прибору. При эксплуатации установок, предусматриваю­щих применение различных газов, возможную угрозу представля­ют поражения органов дыхания, возникновение взрывоопасных смесей, возгорание.