25А. Значение величины Rf для фосфолипидов нри разделении их в разных системах

Подклассы	Подвижные системы
	1	2
Фосфатидиловая кислота	0,87		—
Цереброзиды	—	0,64 (0,55)	0,79
Кардиолипин	0,77	0,55	0,84
Фосфатидилэтаноламин	0,52	0,45	0,58
Фосфатидилинозитол	0,40	0,11	0,20
Фосфатидилхолин	0,27	0,36	0,33
Фосфатидилсерин	0,21	0,06	0,10
Сфингомиелин	0,17	0,18	0,20
Лизолецитин	0,08	0,11	0,15
Старт	0,0	0,0	0,0

Значительную помощь в идентификации отдельных фосфоли­пидов оказывают специальные реакции. Так, фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин обнаруживаются после опрыскивания раствором нингидрида: 3 г нингидрида растворяют в 5 мл лутидина (2,6-диметилпиридин) и добавляют 95 мл н-бутанола, насыщенно­го водой. Появляется малиновая окраска, характерная для ами­ногрупп.

Фосфолипиды, содержащие холин (фосфатидилхолин, лизо-фосфатидилхолин и сфингомиелин), окрашиваются в оранжевый цвет реактивом Драгендорфа, который готовят из двух растворов: раствор I содержит 1,7 г В1(МОз)з • 5Н₂0 в 100 мл 20%-ного рас­твора уксусной кислоты; раствор II содержит 40 г KI в 100 мл воды. Пластинки опрыскивают смесью, состоящей из 4 мл раствора I и 1 мл раствора II с добавлением 20 мл воды.

Фосфатидилинозитол окрашивается в коричневый цвет амми­ачным раствором серебра, который состоит из равных объемов 0,1 н. раствора AgN0₃ и 1 н. раствора NH3.

Количество индивидуальных фосфолипидов после ТСХ опреде­ляют по содержанию в них фосфора по методике, описанной выше для фосфолипидов.

Поскольку фосфолипиды разных подклассов содержат неоди­наковое количество фосфора, их соотношение в исследуемых ма­териалах выражают в мкг (мг) или в процентах неорганического фосфора по отношению к его содержанию в общих фосфолипидах.

3.3.6.4. Количественное определение классов липидов инструментальным методом

Принцип. В основе метода лежит фотометрия плотности окраски отдельных классов липидов, разделенных методом ТСХ, в отраженном или проходящем свете.

Реактивы: пластинки «Силуфол», UV-254 (Чехия) для ка­чественного анализа методом ТСХ размером 150 х 150 мм;

стеклянные пластинки размером 200 х 200 мм;

подвижная фаза: петролейный эфир диэтиловый, эфируксусная кислота (85 : 15 : 1);

с тандартная смесь липидов в хлороформ-метаноловой смеси (2 : 1) (табл. 26);

3—5%-ный раствор фосфорномолибденовой кислоты в этаноле (свежеприготовленный).

Оборудование: денситометр — интегратор или сканиметр (отечественного или зарубежного производства); микрошприц на 1—5 (10) мкл; пульверизатор плюс все оборудование, используемое для разделения липидов методом ТСХ.

Ход определения. На пластинку «Силуфол» (после ее активизации в термостате при 100—105 "С в течение 3—5 мин) на­носят микрошприцем не более 6 проб липидов (по 0,06—0,1 мг) в виде тонкой полосы шириной 8—10 мм (если используют стеклян­ные пластинки с более толстым слоем, то можно нанести 8—9 проб липидов по 0,2—0,3 мг и более). Пластинку опускают в камеру и после разгонки извлекают, подсушивают в горизонтальном поло­жении, осторожно опрыскивают спиртовым раствором фосфорно­молибденовой кислоты и прогревают в сушильном шкафу при 90—100 °С до появления четко выраженных пятен сине-голубого цвета (1—2 мин).

Запись фракций липидов проводят в день их разделения (при хранении обесцвечиваются). Для этого пластинку «Силуфол» раз­резают ножницами по числу нанесенных проб (но не шире 4 см), вкладывают в кассету денситометра и записывают при красном светофильтре в отраженном свете. Каждый класс липидов на хро-матограмме выписывается в виде пика. Порядок расположения пиков тот же, что и на стеклянных пластинках. При разделении липидов сыворотки крови коров триацилглицерины нередко дают 2—3 следующих друг за другом пятна (пика).

Расчет. Относительную величину липидов отдельных клас­сов рассчитывают по величине пиков. Для этого сначала опреде­ляют абсолютную площадь пиков путем умножения его высоты* на ширину на половине высоты от базисной линии. Полученные величины разных пиков суммируют и принимают за 100 %, а затем находят процентную долю каждого пика.

* Для определения истинной высоты пиков, особенно с тупой вершиной, следует их боковые стороны удлинить вверх до пересечения. Точка пересечения и берется за истинную высоту.

Полученные данные, как правило, не отражают действитель­ную величину липидов соответствующего класса. Поэтому для каждого класса следует найти свой поправочный коэффициент. Для этого готовят стандартный раствор — смесь липидов опреде­ляемых классов (см. табл. 26) в хлороформ-метаноловой смеси. Небольшое количество смеси упаривают до концентрации 1—3 %, с помощью микрошприца наносят на пластинку в 8—10 повторностях и разгоняют при тех же условиях, как описано вы­ше. После окраски пики записывают на денситометре и высчи­тывают относительную площадь каждого пика. Затем процентное содержание отдельного класса стандартной смеси делят на про­центное содержание соответствующего класса, найденного после