3.3.6.3. Разделение липидов на классы методом тонкослойной хроматографии (тсх)

Определение содержания отдельных классов липидов после их разделения методом ТСХ имеет ряд преимуществ перед описан­ным выше: во-первых, позволяет получить более точные данные, и, во-вторых, определение отдельных классов липидов можно ав­томатизировать и тем самым сократить время исследований.

Принцип. В основе метода лежит адсорбционная хромато­графия, которая основана на сорбции растворенного вещества твердой фазой — активным сорбентом. Подвижная фаза (раство­ритель разделяемой смеси веществ) движется по неподвижной фа­зе (сорбенту), и при этом разделяемые компоненты перемещаются с различной скоростью в направлении движения растворителя. В качестве сорбента для разделения липидов и фосфолипидов чаще применяют силикагель — соединение с общей формулой Si02 • ИН2О. Адсорбирующие свойства силикагеля объясняются наличием группы —SiOH—, имеющей свободные водородные свя­зи. Присутствие моно- или мультимолекулярных слоев адсорбиро­ванной воды ухудшает разделяющие свойства силикагеля. Поэтому нагревание (активирование) пластинки с силикагелем при 100—115 °С для удаления воды повышает разделяющую способ­ность силикагеля.

Метод ТСХ позволяет разделить сложные смеси липидов на классы: фосфолипиды, моно-, ди- и триацилглицерины, НЭЖК, холестерин свободный и этерифицированный; в свою очередь, фосфолипиды на подклассы, фосфатидилхолин (лецитин), фосфа-тидилэтаноламин и т. д. и тем самым упрощает и повышает точ­ность количественного определения отдельных классов и подклас­сов липидов, а также их выделение для дальнейшего изучения.

Разделение общих липидов на классы методом ТСХ включает сле­дующие операции: приготовление тонкого слоя силикагеля на стекле; активизация его, нанесение общих липидов на тонкий слой; разделе­ние липидов в системе растворителей; проявление и идентификация отдельных классов липидов; их количественное определение.

Реактивы: силикагель для ТСХ с величиной частицы 10—40 мкм, приготовленный путем измельчения отечественного гранулированного силикагеля марки КСК, или силикагель марки ЛС 5/40 (Чехия), или аналогичных марок других фирм;

петролейный эфир с точкой кипения 40—60 °С;

диэтиловый эфир (лучше для наркоза) с точкой кипения 35—36 °С;

уксусная кислота ледяная;

хлороформ перегнанный;

йод кристаллический;

5—10%-ный раствор фосфоромолибденовой кислоты или 10—15%-ный водный раствор серной кислоты;

свидетели—соединения отдельных классов липидов: фосфоли­пидов, триацилглицеридов, НЭЖК, холестерина свободного и эте­рифицированного. В качестве таковых используют лецитин яично­го желтка, трипальмитат или триолеат, пальмитиновую или другую жирную кислоту, холестерин и холестерин-эфир любой кислоты (3—5%-ной концентрации в хлороформе, ч. д. а.).

Оборудование (по Шталю): станок для фиксации плас­тинок, представляющий собой гладко выструганную доску длиной 100—120 см, шириной 20,7 см с гладкими бортиками по краям и высотой 1,5—2 см. В начале и конце станка также устанавливают бортики-ограничители. Перед работой плоскость станка покрыва­ют на всю длину полиэтиленовой пленкой;

металлический аппликатор, позволяющий наносить слой сили­кагеля нужной толщины, который изготавливают из цельнометал­лического прямоугольного бруска нержавеющей стали (он пред­ставляет собой как бы ящик без дна 19 х 5 см по внешним пара­метрам). Сверху с обеих торцевых сторон бруска оставляют специальные выступы для удобства его захвата при работе. Аппли­катор плотно прилегает к поверхности стекла, но его задняя стенка имеет зазор (щель) высотой 3—5 мм, толщина которой регулирует­ся закрепляющейся на винтах подвижной пластинкой (шторкой);

пластинки стеклянные 20 х 20 или любого другого размера; кассета для сушки и хранения готовых пластинок; стеклянная ка­мера (прямоугольник или круглая) с притертой крышкой для хро­матографии; сушильный шкаф; эксикатор; микропипетки на 0,1 мл и более; пульверизатор.

Ход определения. Приготовление тонкого слоя и нане­сение липидов. Хорошо вымытые, обезжиренные стеклянные плас­тинки закладывают в станок. На старт и финиш станка кладу плас­тинки шириной не более 5—6 см. Все стекла еще раз протирают хлороформом. На старт помещают аппликатор с предварительно отрегулированной шириной зазора (250—300 мкм для разделения липидов на классы и 350—500 мкм для разделения фосфолипидов на подклассы), обращенного к переднему концу станка.

В коническую колбу вместимостью 150—200 мл отвешивают си­ликагель (из расчета 5 г на одну пластинку 20 х 20 см) и заливают двойным объемом дистиллированной воды, закрывают пробкой и энергично встряхивают 90 с до получения однородной массы (без пузырьков), затем быстро выливают в аппликатор и непрерывным плавным движением прибора наносят слой силикагеля на стеклян­ные пластинки. Слой должен быть гладким, без пустот и наплывов.

Пластинки оставляют на ночь при комнатной температуре, а перед использованием их помещают в сушильный шкаф на 1—2 ч при 110 "С для активизации. После охлаждения пластинки с ниж­него края ее на 0,3—0,5 см удаляют силикагель, а на 1—1,5 см вы­ше иглой намечают линию старта.

Пробы липидов наносят (осторожно!) микропипеткой или мик­рошприцем с иглой в виде отдельного пятна или полосы шириной 1—1,5 см. Расстояние от краев стекла составляет 2 см, а между про­