22. Приготовление рабочих калибровочных растворов

№ пробирки

1

2 3 4 5

Стандартный раствор, мл

0,1 0,5 1,0 1,0 1,0

Хлороформ, мл

9,9 9,5 9,0 4,0 3,0

Концентрация триацилглице­ринов, мкг/мл

10

50 100 200 250

В 5 опытных пробирок вносят по 1 мл каждого рабочего раство­ра и в шестую пробирку — 1 мл хлороформа для контроля на ре­активы. Все пробирки помещают в кипящую баню на 10 мин для уда­ления хлороформа. Затем в них добавляют по 0,5 мл спиртового рас­твора калия гидроксида и процедуру продолжают, как описано выше. Примечания. 1. Для анализа лучше использовать плазму крови, полученную на холоде, так как при получении сы­воротки происходит частичный гидролиз триацил­глицеринов. 2. В качестве антикоагулянта приме­няют ЭДТА натриевой или калиевой соли (1 мг на 1 мл крови). Гепарин применять не следует, так как он активирует липопротеидную липазу, гидролизи-рующую триацилглицерины. Клиническое значение. Концентрация триацил­глицеринов (нейтральных жиров) в сыворотке крови животных по­вышается при скармливании кормов, обогащенных жирами или богатых легкодоступными углеводами (картофель, зерно кукурузы, пшеницы и др.), активизирующих липогенез в печени (у моногас-тричных). Недостаток в рационах протеина и липотропных ве­ществ (холина, метионина, треонина, селена, витамина Е, никоти­новой кислоты и др.) также сопровождается нарастанием уровня нейтральных липидов в сыворотке крови животных. Увеличение концентрации триацилглицеринов отмечается при острых гепати­тах, жировой дистрофии печени, нефрозах, диабете. Снижение их концентрации наблюдается при низком уровне кормления живот­ных, усиленной молокоотдаче.

Нормативы содержания триацилглицеринов в сыворотке крови животных приведены в приложении 5. Источник: 6, 29.

Определение содержания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) в сыворотке (плазме) крови (по Лауреллу и Тибблингу).

Принцип. Метод основан на образовании комплексных со­единений НЭЖК с медью, которые с дифенилкарбазидом дают ро­зово-малиновую окраску. По сравнению с другими он более чувс­твителен.

Реактивы: экстрагирующая смесь (ЭС) хлороформ-гептан 4 : 3 (по объему), содержащая 2 % метанола;

кремниевая кислота порошкообразная, предварительно активи­рованная при 120 °С 12 ч;

меднотриэтаноламиновый реактив (Си-ТЭА). 10 мл 0,5 моль/л раствора меди нитрата [Си(г<Юз)2]: 10 мл 1 моль/л триэтаноламина (ТЭА) и 3,5 мл 1 моль/л натрия гидроксида растворяют в воде и до­водят объем до 100 мл. В данном растворе растворяют 33 г NaCl, рН доводят до 8,1. Раствор готовят каждые 2 нед;

4%-ный раствор дифенилкарбазида (ДФК) в этаноле. Готовят ежедневно. Непосредственно перед применением 0,1 мл 1 моль/л ТЭА добавляют к 10 мл 0,4%-ного раствора ДФК;

стандартные растворы пальмитиновой кислоты (а. м. = 256,42) — 0,005 и 0,001 мкмоль/л. Для этого 25,642 мг пальмитиновой кислоты растворяют в 100 мл ЭС, получают 1 ммоль/л раствор. Затем 1 мл данного раствора доводят до 10 мл ЭС в мерной колбочке, получа­ют 0,1 мкмоль/л. Далее из данного раствора путем разведения ЭС получают растворы с концентрацией 0,005 и 0,010 мкмоль/л паль­митиновой кислоты.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки с притертыми пробками на 15—20 мл; центрифужные пробирки с притертой пробкой на 10 мл; встряхиватель. Стеклянную посуду, предназначенную для определения НЭЖК, выдерживают несколь­ко часов в 1 моль/л растворе HCI и тщательно моют деминерали­зованной водой.

Ход определения. В пробирку с притертой пробкой вносят 250 мг активированной кремниевой кислоты с последую­щим внесением 9 мл ЭС и по 0,075 мл сыворотки (плазмы). Про­бирки немедленно закрывают, закрепляют со штативом в гори­зонтальном положении на встряхивателе и встряхивают 10 мин, затем дают 15 мин постоять и вновь встряхивают 1—2 мин (можно вручную).

Одновременно готовят стандарт. Для этого в 3 пробирки вносят по 0,5 г кремниевой кислоты, далее в первую пробирку добавляют 9 мл ЭС, во вторую 9 мл 0,005 мкмоль/л и в третью 9 мл 0,010 мкмоль/л раствора пальмитиновой кислоты. Пробирки стан­дарта встряхивают вместе с пробами. Затем пробирки центрифуги­руют 10 мин при 2500—3000 мин и 5 мл верхней фазы переносят в пробирки с притертой пробкой, куда добавляют 2 мл раствора Cu-ТЭА. Опять встряхивают и центрифугируют. После этого 3 мл верхней фазы (осторожно, не касаясь стенок и нижнего слоя) пе­реносят в обычную пробирку (опыт и контроль) и добавляют по 0,5 мл раствора ДФК, перемешивают и оставляют стоять в темном месте. Через 15 мин развивается розово-малиновая окраска, ин­тенсивность которой измеряют на ФЭКе или спектрофотометре при длине волны 550 нм против воды. Расчет ведут по формуле

х = (Л/В) • 120,

где х — содержание НЭЖК, мкмоль/л; А — показатель пробы, мкмоль/л; В — показатель стандарта, мкмоль/л; 120 — постоянный коэффициент.

Перед расчетом из показаний экстракции стандартной пробы (0,010 мкмоль) следует вычесть показания экстинкции слепой пробы.

Расчет можно проводить и по калибровочному графику, кото­рый строят с использованием раствора пальмитиновой кислоты в пределах 0,005—0,025 мкмоль/л.

Клиническое значение. Концентрация НЭЖК в сыворотке крови (см. приложение 5) тесно связана с энергетиче­ской обеспеченностью организма животных и характеризует ак­тивность процессов мобилизации их из жировых депо. Поэтому при недостаточном поступлении энергии в организм, особенно в период раздоя, у самок птиц перед началом яйцекладки и в дру­гих случаях концентрация НЭЖК в сыворотке крови соответс­твенно возрастает в 5—10 раз и более. Часто это предшествует па­раллельному увеличению концентрации кетоновых тел в крови.

Кратковременное повышение концентрации НЭЖК в сыворот­ке крови может быть результатом кормления по рационам, обога­щенным кормовыми жирами; под влиянием инъекций адренали­на; под воздействием стрессовых ситуаций; при сахарном диабете, ожирении, кетозе. Снижается концентрация НЭЖК при введении глюкозы и инсулина.

Источник: 4.

Определение содержания общего холестерина в сыворотке крови.

Принцип. В основу метода положена модифицированная Иль-ком реакция Любермана—Бурхарда, которая дает изумрудно-зеле­ное окрашивание в присутствии холестерина и смеси ледяной ук­сусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной сер­ной кислоты. Данный метод позволяет определять содержание холестерина без предварительной экстракции липидов из сыворот­ки крови.

Реактивы: 1) смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5: 1). При смешивании ингредиентов следует избегать нагревания смеси. Для этого колбу, в которой готовят реактив, помещают в сосуд со льдом, а серную кислоту добавляют в последнюю очередь медлен­но по каплям, постоянно помешивая. Смесь должна быть бес­цветной или слегка желтого цвета и сохраняться в холодильнике;

2) стандартный раствор холестерина: 100 мг холестерина в 100 мл хлороформа.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; термостат; пробирки; штатив для пробирок; пипетки мерные на 0,1 и 5 мл.

Ход определения. К2мл реактива 1 добавляют 0,1 мл негемолизированной сыворотки, встряхивают короткими энергич­ными движениями и помещают в термостат на 20 мин при 37 °С. Окрашенную в зеленый цвет жидкость колориметрируют на спектрофотометре (длина волны 650—660 нм) или на ФЭКе (красный светофильтр) в кюветах диаметром 0,5 см против кон­трольной пробы на реактивы (вместо сыворотки вносят 0,1 мл воды).

Расчет ведут по предварительно составленному калибровоч­ному графику. Рабочий раствор холестерина готовят разведением стандартного в 10 раз (10 мл стандартного раствора + 90 мл хлоро­форма). 1 мл рабочего раствора содержит 0,1 мг холестерина. Затем в пробирки вносят по 0,1; 0,25; 0,50; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3 мл рабо­чего раствора, что соответствует 0,025; 0,05; 0,10; 0,20; 0,25 и 0,30 мг холестерина. В седьмую пробирку вносят 1 мл хлороформа. Пробирки помещают в водяную баню для выпаривания досуха хлороформа; добавляют в них по 2 мл реактива 1 и далее поступа­ют, как описано выше.

При постановке реакции используют абсолютно чистые и со­вершенно сухие пипетки и пробирки. Соотношение ингредиентов реактива рассчитано так, что белки сыворотки не выпадают в оса­док. Появление мути может быть вызвано только наличием воды в реактиве или посуде.

При исследовании холестерина в экстракте липидов его вносят в пробирку в объеме, содержащем не более 1—5 мг чистых липи­дов.

Клиническое значение. Холестерин в сыворотке крови животных находится в двух формах: свободной (1/3) и эфир-носвязанной с различными жирными кислотами (2/3). С возрас­том концентрация холестерина (см. приложение 5) возрастает. Ги-перхолестеринемия отмечается при диабете, нефрозах, понижен­ной функции щитовидной железы; в начале голодания; у свиней и птицы — при скармливании рационов, обогащенных твердыми кормовыми жирами. При острых гепатитах уровень общего холес­терина в начале заболевания обычно повышается, а затем падает ниже нормы. Для заболевания печени характерно падение эфирной фракции холестерина. Острое падение этой фракции в крови — плохой прогностический признак, указывающий на острую желтую атрофию печени или острое отравление ее.

Определение содержания этерифицированного холестерина в сы­воротке крови (по Балаховскому). Принцип. Метод основан на связывании свободного холестерина дигитонином (благодаря чему образуется нерастворимое в хлороформе соединение) и рас-

творении хлороформом эфирносвязанного холестерина. Хлоро-форменный экстракт, содержащий эфирносвязанный холестерин, используется для цветной реакции с реактивом Илька (или с дру­гим специфическим реактивом).

Реактивы: 1) экстрагирующая смесь (ЭС: хлороформ-ме­танол 2 : 1 или этанол-эфир 3:1);

2. 1 %-ный спиртовой раствор дигитонина. 1 г дигитонина рас­творяют в 50 мл этилового спирта и доводят до 100 мл дистилли­рованной водой с подогревом;

3. смесь ледяной уксусной кислоты, уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты (1:5:1). Готовят, как опи­сано выше.

Оборудование: центрифужные пробирки; пробирки с притертыми пробками на 10 мл; пипетки на 0,1, 1 и 5 мл; штатив для пробирок; водяная баня; центрифуга; ФЭК или спектрофото­метр.

Ход определения. 0,1 мл сыворотки (плазмы) крови вносят в центрифужную пробирку, содержащую 5 мл ЭС, тщатель­но перемешивают стеклянной палочкой и оставляют стоять на 5—10 мин при использовании хлороформ-метаноловой смеси или на 1 ч при использовании спирто-эфирной смеси. Затем центри­фугируют в течение 10—15 мин при 2000—3000 мин '. Центрифу-гат осторожно сливают в пробирку с притертой пробкой и ставят в водяную баню для выпаривания (не досуха, оставляют 0,5—1 мл центрифугата). Прибавляют 1 мл раствора дигитонина и переме­шивают. Образуется белый налет — комплекс свободного холесте­рина с дигитонином. Оставляют стоять на 2—3 ч (или на ночь), после чего выпаривают досуха. После охлаждения в пробирку до­бавляют 5 мл хлороформа, тщательно взбалтывают. Хлороформен-ный экстракт фильтруют через обезжиренный бумажный фильтр или сливают после центрифугирования и используют для цветной реакции. С этой целью экстракт упаривают до минимума, добав­ляют 2 мл реактива 3, ставят в темное место на 20 мин, после чего колориметрируют. Хлороформ извлекает эфир холестерина, но не растворяет ни дигитонин-холестериновый комплекс, ни избыточ­ный дигитонин.

Расчет ведут по калибровочной прямой, составленной для общего холестерина. По разности между общим и связанным на­ходят количество свободного холестерина.

Клиническое значение. В норме доля эфирносвя­занного холестерина в сыворотке крови животных достигает 70—90, у птиц 60—70 %. В результате все изменения его содержа­ния отражают главным образом состояние печени и поджелудоч­ной железы, где синтезируется эта фракция. Снижение данной фракции часто является следствием поражения синтетической функции печени и (или) поджелудочной железы.

Источник: 7.

ю*

147

Определение содержания (З-липопротеидов в сыворотке (плазме) крови (по Бурштейну в модификации Виноградовой). Липопротеи­ды (ЛП) сыворотки крови играют важную роль в жизнедеятельнос­ти организма. Они обеспечивают транспорт липидов как экзоген­ного (кормового) происхождения, так и синтезированных в печени и стенке тонкого кишечника (т. е. эндогенного происхождения) в систему циркуляции и далее к местам утилизации или депониро­вания; входят в состав клеточных мембран и ферментов; обезвре­живают токсины; влияют на функцию свертывания крови и т. д.

Важнейшей физиологической функцией отдельных ЛП (а-ЛП) является удаление избытка свободного холестерина из клеток пе­риферических тканей и обратный транспорт их в печень, где он окисляется в желчные кислоты и с желчью через кишечник выво­дится из организма. Наконец, ЛП осуществляет транспорт жиро­растворимых витаминов, в том числе обладающих антиоксидант-ной активностью (а- и у-токоферол, а- и р-каротин, убихинон и др.), а также стероидные гормоны и другие БАВ.

ЛП представляют собой водорастворимые комплексы, состоящие из липидной — холестерина (ХС), триацилглицерина (ТГ), фосфоли-пидной (ФЛ) и белковой части — аполипопротеида (АЛО). Соотно­шение белок : липид может колебаться в широких пределах. И чем больше размер ЛП, тем больше в ней липидная часть, значит, меньше относительная плотность и меньше подвижность при электрофорезе.

Структура ЛП-комплекса, его липидный состав и обмен во многом определяются природой АПО, который активирует или тормозит соответствующие ферменты.

На основе неодинаковой относительной плотности при центри­фугировании в растворах разной плотности или подвижности при электрофорезе в сыворотке крови млекопитающих различают че­тыре класса ЛП (табл. 23): хиломикроны (ХМ) — самый крупный по величине и самый легкий по относительной плотности класс. При центрифугировании флотирует по поверхности (d < 1,006), второй класс — ЛП очень низкой плотности (ЛПОНП, d = = 1,006—1,019) или пре-В-ЛП. Затем идут ЛП низкой плотности (ЛПНП, d = 1,006—1,063) или Р-ЛП и ЛП высокой плотности (ЛПВП, d = 1,063-1,21), или а-ЛП.

П ри электрофорезе ХМ остаются на старте, подобно у-глобули-нам, ЛПОНП, ЛПНП и ЛПВП занимают положение р, ар и а₂-глобулинов соответственно. У птиц в сыворотке крови содер­жится только три класса ЛП, ХМ у них не обнаружены. Как видно из таблицы 23, ХМ и ЛПОНП переносят в крови преимуществен­но ТГ, ЛПОНП - ХС и ЭХ, ЛПВП - ФЛ и ХЭ.

С изменением физиологического состояния организма живот­ных меняется и роль отдельных классов ЛП в обмене липидов. Так, отмечено повышение концентрации ЛПОНП в сыворотке крови высокопродуктивных и жирномолочных коров, а у кур — в период пика яйцекладки.

В лабораторной практике из-за отсутствия доступных методов исследований роль ЛП в обмене веществ оценивают главным об­разом по сумме р-липопротеидов (ЛПОНП + ЛПНП).

Принцип. В основе метода лежит реакция избирательного осаждения р-липопротеидов декстрина сульфатом или гепарином в присутствии двухвалентных катионов.

Реактивы: 1,025 моль/л раствор МпС1₂; 1 %-ный раствор ге­парина (1 мл должен содержать 1000 ME; продажный гепарин, содер­жащий 25 ООО ME в 5 мл, разводят дистиллированной водой 1 : 4).

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; пробирки; штатив для пробирок; стеклянные палочки; пипетки.

Ход определения. 2 мл 0,025 моль/л раствора МпС1₂ вносят в пробирку и прибавляют 0,2 мл сыворотки крови, переме­шивают и определяют оптическую плотность пробы (Е[) на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 0,5 см при длине волны 700—720 нм (красный светофильтр) против воды. Затем в кювету добавляют 0,04 мл 1%-ного раствора гепарина. Пробы тщательно перемеши­вают стеклянной палочкой и строго через 10 мин повторяют фото-метрирование (2^). Разница £₂ — Е\ приходится на оптическую плотность, обусловленную осадком р-липопротеидами. Умножая ее на коэффициент 1164 (определен расчетным способом), получа­ют количество р-липопротеидов в сыворотке крови в мг%.

Примечание. Кровь берут натощак. Сыворотка сохраняется 2 сут.

Клиническое значение. Основная часть липидов сыворотки крови представлена в виде гидрофильных комплексов а- и р-липопротеидов. На долю р-липопротеидов приходится 60—70 % всех липидов сыворотки крови. Печень является не толь­ко местом синтеза, но и активного катаболизма ЛП, а следователь­но, и выведения из организма продуктов обмена липидов (холес­терина). Поэтому определение их концентрации имеет важное клинико-физиологическое значение.

Повышение концентрации р-липопротеидов в сыворотке крови отмечается при скармливании высокожировых кормов, при острых гепатитах, диабете, ожирении, гипотериозе, желтухах; снижение — чаще всего при длительном дефиците в рационе белка (протеина) или незаменимых липотропных аминокислот, когда нарушается синтез апопротеида.

Источник: 5, 8.