21. Приготовление растаоров для ностроеиия калибровочного графика

№ пробирки	Рабочий раствор К2НР04, мл	Бидистиллированная вода, мл	Концентрация фос­фора, мкг/мл
1	0,1	9,9	0,2
2	0,3	9,7	0,6
3	0,5	9,5	1,0
4	2,5	7,5	5,0
5	5,0	5,0	10,0
6	7,5	2,5	15,0
7	10,0	—	20,0

Из каждого разведения берут по 2 мл калибровочного раствора, вносят в 2—3 параллельных пробирки и далее проделывают все операции, как описано выше. На основании полученных данных строят калибровочный график.

Содержание общих фосфолипидов обычно выражают через ко­личество содержащихся в них фосфатов — в ммоль/1 л, содержа­ние отдельных фракций — также через содержание фосфатов или в процентах по отношению к сумме фосфора всех фосфолипидов.

Пересчет фосфора в фосфолипидах путем умножения на 25 нельзя признать правильным, так как это соответствует только для фос-фотидилхолинов (лецитинов), в молекуле которых содержится 4 % фосфора. В других подклассах фосфолипидов доля фосфора иная.

Клиническое значение. Фосфолипиды поступают в кровь главным образом из печени, поэтому их уровень тесно свя­зан с функциональным состоянием данного органа. Концентрация общих фосфолипидов в норме составляет у крупного рогатого ско­та 170—250 мг/100 мл, у свиней — 90—200 мг/100 мл. Повышение концентрации фосфолипидов в сыворотке крови отмечается при стеотозе (жировой дегенерации) печени, тяжелой форме сахарного диабета, нефрозе и нефрите, постгеморрагической анемии. Сни­жение уровня фосфолипидов — частый признак острого и хрони­ческого гепатита различной этиологии; оно отмечается также при неполноценном кормлении, особенно белково-витаминной недо­статочности, при дисбалансе аминокислот в рационе, алиментар­ной дистрофии, анемиях.

Определение содержания триацилглицеринов (по Сардесаю и Ман-нингу). Принцип. Метод представляет собой модификацию метода Ван-Ханделя и Зильверсмита (1957) для прямого определе­ния триацилглицеринов. Глицерол, освобожденный омылением, окисляется до формальдегида, концентрация последнего опреде­ляется колориметрически с применением реакции Hantzsch. Дан­ный метод позволяет выявить триацилглицерины во всех биологи­ческих субстратах — сыворотке крови, печени, мышцах, жировой ткани и др.

Кровь с гепарином или с ЭДТА может храниться в вакуумной пробирке в течение 8 ч. Пробы не замораживают.

Реактивы: экстрагирующая смесь (хлороформ-метанол 2 : 1 или спирт-эфир 3:1);

кремниевая кислота (силикагель), активированная при 105 °С в течение 10—12 ч;

спиртовой раствор калия гидроксида (КОН). 2 г КОН растворя­ют в минимальном количестве дистиллированной воды и объем доводят 95%-ным этиловым спиртом до 100 мл (основной рас­твор). Для приготовления рабочего раствора 10 мл основного рас­твора доводят 95%-ным этиловым спиртом до 50 мл (готовят в день применения);

0,1 моль/л раствор серной кислоты;

0,05 моль/л раствор метперйодата (NalO^;

0,5 моль/л раствор натрия арсенита (NaAs02);

ацетил-ацетоновый реактив, рН 6,0 при 25 °С. 150 г аммония ацетата, 3 мл ледяной уксусной кислоты и 2 мл ацетил-ацетоново­го реактива растворяют в 1 л дистиллированной воды. Реактив сто­ек в течение 2 нед при хранении в холодильнике;

1 %-ный стандартный раствор триацилглицеринов. 1 г триолеи-на или оливкового масла растворяют в 100 мл хлороформа. Хранят в холодильнике, стоек 2 мес.

Оборудование: спектрофотометр или ФЭК; водяная ба­ня; пробирки обычные и центрифужные с делением; колбочки или пробирки на 10 мл; делительные воронки на 25 и 50 мл.

Ход определения. 0,1мл сыворотки (плазмы) вносят в колбочку, заливают экстрагирующей смесью и тщательно пере­мешивают. Через 2—3 мин содержимое пропускают через обезжи­ренный бумажный фильтр в мерную колбочку, доводят объем экс­трагирующей смесью до 10 мл. В делительную воронку на 25 мл вносят 8 мл дистиллированной воды и 8 мл фильтрата (что соот­ветствует 0,08 мл сыворотки). Содержимое хорошо перемешивают, отстаивают и нижний слой пропускают через стеклянную колонку размером 0,8 х 16 см (для задержки фосфолипидов), приготовлен­ную следующим путем: в центрифужную пробирку со спиленным дном помещают кусочек стеклянной ваты и 0,5 г активированной кремовой кислоты. Перед использованием колонку промывают 5 мл хлороформа. Фильтрат пробы собирают в мерную колбочку на 10 мл или пробирку с делениями. Колонку промывают хлоро­формом, который также собирают в колбочку. Объем доводят хло­роформом до метки. Затем в 3 пробирки вносят по 3 мл фильтрата (что соответствует 0,024 мл сыворотки или плазмы) и после выпа­ривания растворителя в водяной бане в первые две пробирки до­бавляют по 0,5 мл спиртового раствора КОН (омыляемые пробы), а в третью — 0,5 мл спирта (неомыляемая проба). Пробирки инку­бируют в водяной бане 15 мин при 60 "С. В конце инкубации в каждую из них добавляют по 0,5 мл 0,2 н. раствора серной кисло­ты, а затем по 0,1 мл 0,05 моль/л раствора метперйодата натрия (для окисления глицерина, освобожденного омылением).

Через 10 мин (точно!) окисление приостанавливают добавлени­ем по 0,1 мл 0,5 моль/л раствора натрия арсенита. Через 5—7 мин, когда испарится осводившийся йод, пробирки извлекают из бани и в них добавляют по 0,8 мл воды и по 2 мл ацетил-ацетонового ре­актива. Содержимое тщательно перемешивают перевертыванием пробирки и инкубируют в водяной бане при 58 "С в течение 10 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры и колориметрируют при длине волны 412 нм в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контроля.

Степень поглощения омыляемой пробы минус степень погло­щения неомыляемой пробы соответствует количеству триацилгли­церинов, содержащихся в 0,24 мл исходного объема сыворотки (плазмы) крови. В используемом объеме сыворотки (плазмы) кро­ви показания неомыляемых проб обычно очень малы и не имеют существенного значения.

Расчет ведут по формуле или калибровочному графику, ко­торый строят в пределах от 10 до 250 мкг/мл триацилглицеринов.

* ~ (£<эп/^ст) От,

где х — количество триацилглицеринов, мкг%; Е_оп — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция стандартной пробы; С_ст — концентрация триолеина в стандартном растворе, мг%.

Из основного раствора готовят серию рабочих калибровочных растворов (табл. 22).