3.3.6.1. Выдел ениелипидов из биологических субстратов

В основе выделения липидов лежат такие операции, как экстра­кция, очистка их от нелипидных компонентов, концентрация и определение суммарного выхода липидов методом взвешивания на аналитических весах. Среди известных в настоящее время методов выделения липидов из биологических материалов в лабораторной практике наиболее распространен метод экстракции хлоро-форм-метаноловой смесью; реже прибегают к экстракции спирто-во-эфирной смесью.

Метод экстракции липидов хлороформ-метаноловой смесью (по Фолчу). Принцип. Метод заключается в разрушении липид-но-белковых связей полярными растворителями (в данном случае метанолом), что облегчает последующее экстрагирование липидов неполярными растворителями (хлороформом, диэтиловым или петролейным эфиром). В данном случае полярные и неполярные растворители представлены в виде одной смеси. Метод пригоден для извлечения липидов из любых тканей животного и раститель­ного происхождения. В настоящее время считается универсаль­ным. Обязательное требование данного метода — соблюдение со­отношения субстрата и растворителя 1 : 20.

Реактивы: хлороформ. Из хлороформа необходимо удалить фосген, который реагирует с окси- и аминогруппами липидов. Свежий продажный хлороформ достаточно перегнать и хранить в темной бутылке с добавлением 1 % метанола (или этанола), кото­рый препятствует образованию фосгена;

метанол освобождают от альдегидов перегонкой над гранулиро­ванным калия гидроксидом. Перегнанный метанол хранят в тем­ной бутылке 1—2 мес;

смесь хлороформ-метанола в соотношении 2 : 1 по объему (смесь 1);

смесь растворителей верхней фазы, содержащая минеральные соли (смесь 2): хлороформ-метанол-водный раствор соли в соотно­шении 3 : 48 : 47 по объему. В качестве солей могут быть исполь­зованы КС1 (0,75 %), NaCl (0,58 %) или СаС1₂ (0,04 %);

антиоксидант бутилокситолуол (БОТ, ионол).

Оборудование: пробирки обычные и с притертыми про­бками вместимостью 10, 20 и 50 мл; цилиндры мерные с притер­тыми пробками вместимостью 25, 50 и 100 мл; конические колбоч­ки с плоским дном обычные и с притертыми пробками на 50 и 100 мл; пипетки с делениями разных объемов; гомогенизатор; во­доструйный насос; роторный испаритель; аналитические весы.

Ход определения. В пробирку или колбу наливают не­обходимое количество смеси 1, из пипетки вносят необходимый объем сыворотки (плазмы) крови или молока (например, 40 мл хлороформ-метаноловой смеси и 2 мл сыворотки в соотношении 1 : 20). Чтобы избежать окисления липидов, к пробам добавляют антиоксидант бутилокситолуол (БОТ), который вносят с метано­лом в количестве 0,1 % от количества липидов. Смесь тщательно перемешивают стеклянной палочкой или покачиванием колбы и оставляют стоять или подогревают на водяной бане при 40—45 "С 2—3 мин, затем фильтруют через обезжиренный бумажный или стек­лянный фильтр в мерный цилиндр на 50 мл с притертой пробкой.

Желток яйца вносят в предварительно взвешенную колбочку, взвешивают и заливают смесью 1.

Печень или мышечную ткань отвешивают, помещают в стакан гомогенизатора, добавляют такое же количество физраствора и го­могенизируют 2—3 мин. Затем отвешивают необходимое количес­тво (2—6 г) гомогената в плоскодонную колбочку, заливают 20 час­тями смеси 1, тщательно перемешивают стеклянной палочкой, ос­тавляют стоять в течение 1 ч или подогревают на водяной бане в течение 5—10 мин и потом фильтруют в мерный цилиндр.

Для экстракции липидов из кормов или сухих образцов живот­ных тканей их измельчают, заливают смесью 1, колбочки закрыва­ют пробкой и оставляют для экстракции на 18—24 ч (с периодиче­ским перемешиванием) или встряхивают на игуттель-аппарате в те­чение 1,5—2 ч. Содержимое подогревают при 45—50 "С 5—10 мин и фильтруют.

Для удаления нелипидных соединений из экстракта к последне­му добавляют 1/5 объема воды (это соотношение следует строго соблюдать, так как в противном случае расслоение смеси на две фазы не произойдет). Цилиндр закрывают притертой пробкой, энергично встряхивают до образования молокообразной взвеси и оставляют стоять на ночь для расслоения или содержимое перено­сят в пробирки и центрифугируют.

Верхний водно-спиртовой слой (= 40 %), содержащий нелипид-ные вещества, удаляют микробиологической пипеткой, присоеди­ненной к водоструйному насосу или к шприцу. При этом нельзя затрагивать пограничную (липопротеидную) пленку. Если она со­держит много нелипидных соединений (рыхлая, белого цвета), то ее следует отмыть. Для этого по стенке цилиндра пипеткой насла­ивают 1—2 мл смеси 2. Цилиндр осторожно поворачивают вокруг своей оси, и смесь отсасывают. При необходимости эту операцию повторяют 2—3 раза. Утонченную пленку растворяют каплями ме­танола.

В нижнем хлороформном слое (~ 60 %) концентрируются ли-пиды. Для определения количества экстрагированных из исследу­емой пробы липидов можно использовать два метода.

1. Исходный экстракт переносят в предварительно обезжирен­ную и взвешенную колбу со шлифом, присоединяют к роторному испарителю и отгоняют хлороформ под вакуумом (присоединяя к водоструйному насосу) с подогревом до 40 °С. Эта операция зани­мает 5—7 мин.

Если на стенке отгонной колбы остаются капли воды, их удаля­ют добавлением 0,2—0,3 мл ацетона с последующей его отгонкой.

После этого колбы с липидами тщательно протирают полотенцем и в открытом состоянии помещают в эксикатор, заполненный вла-гопоглощающим веществом. Через 2—3 ч взвешивают на аналити­ческих весах. Определяют количество липидов, добавляют в колбу определенное количество хлороформ-метаноловой смеси (для по­лучения раствора нужной концентрации), тщательно растворяют липиды и переносят их в пробирку с притертой пробкой, продува­ют азотом, закрывают и хранят в холодильнике.

2. Экстракт липидов доводят до определенного объема. 1—2 мл раствора переносят в предварительно взвешенный бюкс или не­большой стакан и помещают на песчаную баню под вытяжным шкафом или в термостат при 60 "С. Высушивают до постоянной массы. На основании количества липидов, обнаруженных в высу­шенном объеме экстракта, определяют концентрацию липидов в исследуемом субстрате.

Исходный или концентрированный экстракт после определе­ния в нем концентрации липидов используют для определения со­держания фосфолипидов, триацилглицеринов, холестерина или изучения жирнокислотного состава общих липидов.

Метод экстракции липидов спиртово-эфирной смесью (по Блюру). Принцип. Метод аналогичен предыдущему, но для экстракции применяют смесь других полярных (этиловый спирт) и неполяр­ных (диэтиловый эфир) растворителей. В результате данный метод не обеспечивает полной экстракции фосфолипидов, ганглиозидов и протеолипидов.

Реактивы: смесь этилового эфира и диэтилового эфира (3 : 1); петролейный эфир.

Оборудование: пипетки на 1, 5 и 10 мл; колбочки с при­тертой пробкой на 50 и 100 мл; воронки; пробирки с притертой пробкой; бумажные фильтры; роторный испаритель; водяная баня; аналитические весы.

Ход определения. В плоскодонную колбу вносят не­обходимый объем сыворотки крови (1—3 мл или больше) или не­сколько граммов гомогената тканей, заливают 20 объемов спирто­во-эфирной смеси, перемешивают и оставляют на 12 ч при ком­натной температуре. Экстракцию можно ускорить кратковремен­ным подогревом (2—3 мин) при температуре 40 °С. Липидный экстракт отфильтровывают от выпавшего белка и концентрируют выпариванием на роторном испарителе. Затем липиды экстрагиру­ют тремя порциями петролейного эфира, отбрасывая нераствори­мый осадок. Концентрацию липидов в экстракте определяют взве­шиванием одним из изложенных выше методов.

Экстракт используют для определения главным образом холес­терина и триацилглицеринов, поскольку фосфолипиды экстраги­руются не полностью.

Клиническое значение. Физиологическая гипер-липемия отмечается через 1—3 ч после скармливания животным кормов, обогащенных липидами, а также у кур, индеек, уток, гусей и других птиц (самок) в период их полового созревания, подготов­ки к яйцекладке и в период интенсивной продуктивности. Пато­логическая гиперлипемия наблюдается у коров с патологией обме­на веществ и алиментарным бесплодием, при концентратном типе кормления, ожирении, остром и хроническом гепатите, хрониче­ском нефрите, гипофункции щитовидной железы, передней доли гипофиза, недостаточной активности сывороточной липопротеи-новой липазы (ЛПЛ), расщепляющей триацилглицерины сыворот­ки крови (фактор просветления).

Концентрация общих липидов в сыворотке крови в норме со­ставляет у крупного рогатого скота 280—600 мг/100 мл, у свиней — 350-400, кур 360-2100 мг/100 мл.

Источник: 57.

Определение общих липидов в сыворотке крови с сульфофосфова-нилиновым реактивом (по Цёлнеру—Киршу в изложении Л. В. Орло­ва). Принцип. Метод основан на цветной реакции продуктов распада ненасыщенных липидов в серной кислоте с реактивом, со­стоящим из ванилина и ортофосфорной кислоты. Механизм цвет­ной реакции заключается в том, что ненасыщенные липиды реа­гируют с серной кислотой при нагревании с образованием карбо-ниевого иона, взаимодействие которого с активированной кар­боксильной группой ванилина фосфата образует стабильный комплекс. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию общих липидов в сыворотке крови.

Реактивы: серная кислота (H3SO4) концентрированная (х. ч.) или для пробы Соваля;

ортофосфорная кислота (Н3РО4) концентрированная;

ванилин (х. ч.), 0,6%-ный раствор. 0,6 г ванилина растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды с нагреванием на водяной бане, после охлаждения доводят объем до 100 мл. Раствор стабилен при хранении при комнатной температуре;

фосфор-ванилиновый реактив. 4 части ортофофорной кислоты смешивают с 1 частью 0,6%-ного раствора ванилина. Хранят в тем­ной склянке при комнатной температуре;

хлороформ (х. ч. или для наркоза);

стандартный раствор в хлороформе триолеина или холестерина (х. ч.) со свежим топленым и профильтрованным сливочным мас­лом в соотношении 1: 3 или общие липиды, выделенные из сыворот­ки крови или печени. Взвешивают на аналитических весах 1200 мг триолеина или других указанных липидов и растворяют в мерной колбе на 100 мл. Хранят в темной склянке с притертой пробкой в холодильнике.

Оборудование: ФЭК или спектрофотометр; водяная ба­ня; термостат; колбы мерные; пипетки; пробирки.

Ход определения. В пробирки (высотой 15 см) с 0,01 мл сыворотки крови добавляют 0,5 мл концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и ста­вят в кипящую водяную баню или термостат при температуре 130 "С на 20 мин. Водяная баня должна быть заполнена водой не ниже уровня жидкости в пробирках, поставленных в нее. Исполь­зуемые для анализа пробирки и другую посуду моют отдельно, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и спиртом. Че­рез 20 мин пробирки охлаждают под водопроводной водой, прили­вают 1,5 мл сульфофосфованилинового реактива, тщательно встряхивают и выдерживают в темноте при комнатной температуре 45 мин. Содержимое пробирки постепенно меняет желтый цвет на красный, который стабильно удерживается до 18 ч.

Через 1 ч определяют оптическую плотность на ФЭКе или спек­трофотометре при зеленом фильтре (500—560 нм) в кювете с толщиной слоя 0,5—1 см против холостой пробы. Холостую пробу готовят так же, как и опытную, но вместо сыворотки берут 0,01 мл воды. Если концентрация липидов низкая и недостаточно улавли­вается на ФЭКе, то для исследования берут двойную дозу сыворот­ки (0,02 мл).

Расчет ведут по калибровочному графику. Для его постро­ения из стандартного раствора триолеина готовят рабочие калиб­ровочные растворы (табл. 20).