18. Схема постановки реакции для определения билирубина

Реактив, мл	Контроль для об­щего билируби­на, мл	Общий били­рубин, мл	Контроль для свя­занного билируби­на, мл	Связанный билирубин, мл
Разведенная сы-	0,5	0,5	0,5	0,5
воротка 1: 1
Кофеиновый ре-	1,75	1,75	—	—
актив
0,9%-ный раствор	0,25	—	2	1,75
NaCl
Диазосмесь	—	0,25	—	0,25

Из показателя оптической плотности проб общего и связанного билирубина вычитают показатель оптической плотности конт­рольных проб и по калибровочному графику определяют содержа­ние общего и связанного билирубина в мг/100 мл сыворотки крови или в мкмоль/л, а по разнице между ними — содержание свобод­ного (неконъюгированного) билирубина.

Источник: 20.

Клиническое значение. Билирубин — желчный пигмент, образуется в клетках ретикулоэндотелиальной системы печени и селезенки при распаде гемоглобина, миоглобина, ци-тохромов. Он ядовит, плохо растворим в воде. При поступлении с кровью в печень в гепатоцитах происходит обезвреживание его пу-

тем присоединения глюкуроновой кислоты. Соединения билиру­бина с глюкуроновой кислотой (моно- и диглюкурониды) раствори­мы в воде и непосредственно реагируют с диазореактивом. В этих соединениях заключен так называемый прямой (связанный) били­рубин, который выделяется в желчь и поступает в кишечник, где превращается в уробилиноген.

В сыворотке крови животных содержится билирубин, связан­ный с глюкуроновой кислотой, или прямореагирующий, и конъ-югированный свободный непрямореагирующий билирубин.

Повышение содержания билирубина в сыворотке крови (гиперби-лирубинемия, желтуха) отмечается при гепатите, циррозе печени, острой токсической гепатодистрофии, опухолях печени. При этих болезнях увеличивается уровень в крови как несвязанного (свобод­ного), так и связанного (конъюгированного) билирубина. При ге­молитической желтухе, обусловленной гемолитическими ядами или кровопаразитами (протозоо), концентрация билирубина в кро­ви повышается в основном за счет свободного (несвязанного) би­лирубина. В последнее время разделению билирубина на фракции в клинике не придают особого значения, оценивают в основном количество общего билирубина.

Коллоидно-осадочные пробы. Для оценки белковосинтетизиру-ющей функции печени, диагностики и прогнозирования бронхо­пневмонии и других патологических состояний широко использу­ют осадочные пробы. Применение их основано на изменениях коллоидной устойчивости белков в сыворотке крови.

У здоровых животных белки в сыворотке крови находятся в коллоидном состоянии и отличаются высокой устойчивостью. При многих заболеваниях изменяется белковый спектр сыворотки кро­ви, наступает диспротеинемия — снижение содержания альбуми­нов и повышение количества глобулинов, вследствие чего коллоид­ная устойчивость белков сыворотки крови снижается, под действи­ем определенных веществ наступает преципитация, приводящая к помутнению.

Предложено много осадочных проб с применением реакции Токата (пробы Токата, Гросса, сулемовая); тимоловая проба; кофе­ин-холестериновая проба; цинк-сульфатная проба; реакция Валь-тмана; золото-коллоидная проба; проба с сульфатом меди и др.

Хотя осадочные пробы не специфические, однако позволяют устанавливать степень нарушения соотношений между альбумина­ми и глобулинами сыворотки крови. Положительные коллоид­но-осадочные пробы чаще обусловлены увеличением содержания глобулинов и уменьшением количества альбуминов. Ускорение коллоидно-осадочных реакций наблюдается также вследствие уве­личения грубодисперсных белков —у-глобулинов при нормальном коэффициенте альбуминов (глобулинов).

Осадочные пробы в сочетании с данными клинического состо­яния животных, наличием признаков заболевания печени, легких или других органов — ценные диагностические тесты.

Сулемовая проба. Принцип. Сулема в присутствии мелко­дисперсных коллоидов (белков) образует коллоидный раствор со­лей ртути. Нарушение дисперсности белковых фракций сыворотки крови вызывает осаждение грубодисперсных частиц.

Реактивы: при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота 100 мг двухлористой ртути растворяют в воде в мер­ной колбе вместимостью 100 мл (100 мг%-ный). При исследовании сыворотки крови кур и лошадей берут 600 мг сулемы, растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл (600 мг%-ный);

натрия хлорид, 154 ммоль/л (0,9%-ный). 9 г соли растворяют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 1 л.

Оборудование: микробюретка на 2 или 5 мл с оттянутым носиком; стаканчики на 50 мл.

Ход определения. В стаканчик вносят 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 0,5 мл сыворотки крови, перемешива­ют. Из микробюретки (или пипетки) медленно, по каплям с ин­тервалом 20—30 с титруют до стойкого помутнения, при котором через вертикальный слой жидкости нельзя прочитать газетный текст. Результат выражают в мл раствора сулемы, пошедшего на титрование.

Источник: 43.

Примечание. Концентрация раствора сулемы для сыворотки крови крупного рогатого скота, лошадей и кур на­ми (И. П. Кондрахин) подобрана опытным путем.

Клиническое значение. В норме показатель суле­мовой пробы у взрослого крупного рогатого скота 1,6—2,6 мл 100 мг% раствора сулемы, у кур и лошадей 1,6—2,6 мл 600 мг% раствора сулемы. При гепатите, циррозе печени, гепатодистрофии показатель сулемовой пробы ниже 1,6 мл, доходит до 0,9—0,7 мл. Чем тяжелее процесс в печени, тем выраженнее диспротеинемия, тем меньше показатель сулемовой пробы. Высокий показатель су­лемовой пробы указывает на нарушение коллоидной устойчивости белков сыворотки крови. Такое явление отмечается при снижении содержания общего белка в сыворотке крови. Между уровнем об­щего белка в сыворотке крови и показателем сулемовой пробы на­ми установлена отрицательная корреляция, т. е., чем больше белка в сыворотке крови, тем меньше показатель сулемовой пробы. Но эта связь не сильно выражена, бывают случаи, когда при невысо­кой концентрации общего белка в сыворотке крови сулемовая проба оказывается положительной.

Цинк-сульфатные осадочные пробы. Применение сулемы (ртуть двухлористая, HgCl) в лабораторной практике крайне ограничено в связи с трудностями ее приобретения и особым режимом хране­ния. Поэтому нами (И. П. Кондрахин) разработаны осадочные

пробы с использованием цинка сульфата. Цинка сульфат при стро­го определенной концентрации вызывает преципитацию белков сыворотки крови подобно 0,1%-ному раствору сулемы. Оптималь­ную концентрацию растворов цинка сульфата подбирали опытным путем. В настоящее время предложена и апробирована печеночная осадочная проба и бронхолегочный тест с цинка сульфатом для ис­следования сыворотки взрослого крупного рогатого скота, свиней, кур-несушек, лошадей.

Цинк-сульфатная осадочная печеночная проба (по И. П. Конд-рахину). Принцип. Цинка сульфат вызывает преципитацию белков сыворотки крови и ее помутнение. Скорость этого процес­са зависит от содержания в ней альбуминов и глобулинов, а также патологических белков — парапротеинов: чем меньше альбуминов и больше глобулинов или парапротеинов, тем быстрее происходит коагуляция белков и помутнение сыворотки крови.

Реактивы: цинка сульфат 7-водный (ZnS04 • 7Н2О, ч. д. а. или х. ч.): а) при исследовании сыворотки крови взрослого круп­ного рогатого скота готовят 55 мг%-ный (1,91 ммоль/л) раствор цинка сульфата: 55 мг вещества растворяют водой в мерной колбе вместимостью 100 мл; б) при исследовании сыворотки крови сви­ней готовят 100 мг%-ный (3,484 ммоль/л) раствор цинка сульфата;

в) при исследовании сыворотки крови кур-несушек — 110 мг%;

г) при исследовании сыворотки крови лошадей готовят 125 мг%-ный (4,355 ммоль/л) раствор: 125 мг цинка сульфата растворяют водой в мерной колбе вместимостью 100 мл;

натрия хлорид (NaCl, ч. д. а., х. ч.) 0,9%-ный (154 ммоль/л). 9 г натрия хлорида растворяют водой в мерной колбе вместимостью 1000 мл.

Оборудование: стаканчики вместимостью 50 мл; мик­робюретки на 2 или 5 мл с оттянутым носиком; пипетки; мерные колбы.

Ход определения. В стаканчик вносят 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида и 0,5 мл сыворотки крови, смешивают и медленно титруют по каплям 55 мг%-ным (1,91 ммоль/л) или 100 мг%-ным (3,484 ммоль/л), или 125 мг%-ным раствором суль­фата цинка до тех пор, пока через вертикальный слой жидкости нельзя будет прочитать газетный шрифт. Нормальные величины в том и другом случаях — 1,6—2,6 мл. Показатель ниже 1,6 мл свиде­тельствует о нарушении белковосинтезирующей функции печени.

Цинк-сульфатный бронхолегочный тест (цинк-сульфатная оса­дочная проба) по И. П. Кондрахину. Для диагностики бронхопнев­монии (пневмонии) в ветеринарии преимущественно используют осмотр, аускультацию, перкуссию, которые не позволяют объек­тивно оценивать тяжесть заболевания. В связи с этим нами разра­ботан бронхолегочный тест с использованием цинка сульфата, позво­ляющий проводить своевременную диагностику, определять стадию воспалительного процесса в легких, тяжесть заболевания, оценивать эффективность лечения и прогнозировать течение болезни.

Принцип. Метод основан на выявлении диспротеинемии (гиперглобинемии и гипоальбуминемии), которая присуща пнев­монии, бронхопневмонии. Это достигается добавлением к сыво­ротке крови раствора цинка сульфата, вызывающего ее преципи­тацию и помутнение. Чем тяжелее воспалительный процесс в лег­ких, тем больше выражена диспротеинемия и тем быстрее идут преципитация и помутнение сыворотки крови.

Реактивы: цинка сульфат 7-водный (ZnS04 • 7Н2О, ч. д. а. или х. ч.), 75 мг%-ный (2,613 ммоль/л) раствор цинка сульфата. 750 мг вещества растворяют в воде в мерной колбе на 1000 мл. Рас­твор стабилен в течение 2 мес;

натрия хлорид (NaCl, ч. д. а. или х. ч.), 0,9 %-ный (154 ммоль/л) раствор натрия хлорида. 9 г вещества растворяют в воде в мерной колбе на 1000 мл.

Оборудование: стеклянные стаканчики на 50 мл; мик­робюретка с оттянутым носиком на 5 мл; пипетки; мерные колбы.

Подготовка образцов крови к анализу. Кровь у телят берут из яремной вены в сухие х. ч. пробирки, соб­людая правила асептики и антисептики. Чтобы избежать гемолиза, кровь в пробирки набирают по стенке.

В лабораторию образцы крови доставляют в день взятия. Для получения сыворотки пробирку с кровью обводят тонкой спицей из нержавеющей стали и ставят в термостат при температуре 37—38 "С на 1—2 ч или оставляют при комнатной температуре для окончательного отделения сыворотки. Сыворотку сливают в цент­рифужные пробирки и центрифугируют 15 мин при 3000 мин '. Для исследования пригодна сыворотка без гемолиза. Анализ про­водят в течение первых двух дней после взятия образцов крови.

Ход определения. В стаканчик вносят поочередно 1 мл 0,9%-ного раствора натрия хлорида, 0,5 мл сыворотки крови, пе­ремешивают. Из микробюретки медленно по каплям с интервалом 1—3 с в стаканчик добавляют 75 мг%-ный раствор цинка сульфата до помутнения содержимого, когда через вертикальный слой жид­кости нельзя прочесть газетный текст. Записывают результат.

Клиническое значение. Воспаление легких сопро­вождается повышением содержания в сыворотке крови глобулинов и снижением количества альбуминов. Чем тяжелее воспалитель­ный процесс, тем сильнее выражена диспротеинемия, тем меньше пойдет раствора цинка сульфата для осаждения грубодисперсных белков — глобулинов.

У клинически здоровых телят в возрасте 1—3 мес величина бронхолегочного теста составляет 1,7—2,7 мл, при легкой и сред­ней тяжести бронхопневмонии — 1,5—1,3, при тяжелом затяжном течении болезни — 1,2 мл и менее. При показателе легочного теста 0,9—0,8 мл и менее прогноз болезни, по нашим наблюдениям, не­благоприятный. Повышение показателя бронхолегочного теста свидетельствует о положительном лечебном эффекте (выздоровле­нии животного), снижение — об неэффективности лечения, усу­гублении патологического процесса. В случаях, когда патологиче­ский процесс в легких существенно не изменяется, показатель бронхолегочного теста остается на прежнем уровне. Источник: 35.

3.3.5. МЕТОДЫ ОЦЕНКИ СОСТОЯНИЯ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА

Для оценки состояния углеводного обмена определяют содержа­ние в крови глюкозы, молочной и пировиноградной кислот, в клет­ках крови и печени-гликогена и других веществ. В сочетании с дру­гими клиническими и лабораторными показателями они имеют определенное диагностическое значение. Применяют методы на­грузки галактозой, пробы с инсулином, адреналином и т. д.

Определение глюкозы в крови, моче по цветной реакции с ор-то-толуидином. Принцип. Глюкоза при нагревании с орто-то-луидином в растворе уксусной кислоты дает окрашенное соедине­ние, интенсивность окрашивания которого пропорциональна кон­центрации глюкозы. Анализ проводят не позднее 24—48 ч.

Реактивы: орто-толуидин (CH3C6H4NH2, ч.), обязательно подлежит перегонке в колбе-реторте при температуре 200 "С (на песочной бане). Свежеприготовленный орто-толуидин должен быть бесцветным или слабо-желтого цвета. Экстинкция при 590—655 нм против воды не должна превышать 0,02. Реактив стоек при хранении в посуде темного стекла без доступа воздуха;

ледяная уксусная кислота (х. ч.);

20%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

тиомочевина (ч. д. а.);

0,2%-ный раствор бензойной кислоты. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 99,8 мл дистиллированной воды. Для более быстрого растворения нагревают на водяной бане;

орто-толуидиновый реактив. В 94 мл ледяной уксусной кислоты растворяют 0,15 г тиомочевины и добавляют 6 мл орто-толуидина. Реактив стоек при хранении в холодильнике;

калибровочный раствор глюкозы для ее определения в крови жвачных животных 500 мг/л (2,777 ммоль/л) и у моногастричных животных 1000 мг/л (5,555 ммоль/л). 500 мг или 1000 мг глюкозы, высушенной до постоянной массы, растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 мл в 0,2%-ном растворе бензойной кислоты или в воде. Экстинкция калибровочного раствора не должна давать резких колебаний, в противном случае необходимо готовить новый раствор. Хранят калибровочный раствор в холодильнике.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; колба-реторта; песочная баня; водяная баня; термос на 3—5 л; пробирки центри­фужные.

Ход определения. Подготовка безбелкового фильтрата крови. В центрифужную пробирку вносят 5 мл 20%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, 5 мл цельной крови и перемешивают. Готовят все на месте в момент взятия крови у животных. Пробирки помещают в термос со льдом, доставляют в лабораторию, где пробир­ки помещают в центрифугу на 20—30 мин при 3000 мин^-1. Верх­ний слой (безбелковый фильтрат) сливают в другую пробирку и в нем определяют глюкозу. (Можно, кроме того, определять неорга­нический фосфор и магний.) Хранят безбелковый фильтрат крови в холодильнике не более 5 дней.

Проведение анализа. В пробирку вносят 0,2 мл безбелкового фильтрата крови, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-то-луидинового реактива. Пробирку помещают в кипящую водяную баню на 8 мин (точно). Вода должна непременно кипеть. После че­го сразу охлаждают до комнатной температуры под водопроводной водой. Фотометрируют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 10 мм против контроля при длине волны 580—650 нм (оранжевый или красный светофильтр).

Контроль. 0,4 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты, 0,6 мл дистиллированной воды, 9,0 мл орто-толуидинового реактива (на две кюветы). Параллельно готовят калибровочную пробу.

Калибровочную пробу ставят так же, как опытную, но вместо безбелкового фильтрата крови берут 0,1 мл раствора глюкозы с концентрацией 50 или 100 мг%, 0,1 мл 20 %-ного раствора ТХУ, 0,3 мл дистиллированной воды и 4,5 мл орто-толуидинового реактива.

Расчет ведут по формуле

С_оп = т?² •⁵⁰ (или ¹⁰°).

^Ек

где С_оп — концентрация глюкозы в пробе, мг%; Е_оп — оптическая плотность пробы; Е_к — оптическая плотность калибровочного раствора; 50 (или 100) — коэффициент для пересчета в мг% (калибровочный раствор содержит 50 или 100 мг% глюкозы).

Для выражения глюкозы в ммоль/л коэффициентом при 50 мг%-ном растворе будет 2,777, а при 100 мг%-ном — 5,555. При переводе мг% в ммоль/л полученную величину умножают на 0,0555.

Определение глюкозы в моче. После проведения качественной пробы на содержание глюкозы в моче в зависимости от характера реакции разводят мочу в 2—10 раз. 0,1 мл разведенной мочи сме­шивают с 4,5 мл орто-толуидинового реактива и далее обрабатыва­ют и измеряют, как указано для крови. При расчете результатов со­ответственно надо учитывать разведение мочи.

Примечания. 1. Построение калибровочного графика не реко­мендуется, так как интенсивность окраски проб зависит от условий опыта. Поэтому правильнее обрабатывать калибровочные пробы одновремен­но с опытными и вести расчет по приведенной выше формуле. 2. При исследовании крови сви­ней и лошадей целесообразно готовить стандарт­ный раствор с содержанием 100 мг% глюкозы. В этом случае коэффициент для пересчета будет не 50, а 100. 3. Для снижения скорости гликолиза целесообразно кроме антикоагулянта добавлять фтористый натрий в количестве 2,5 мг/мл. В этом случае осаждение крови ТХУ не требуется и для анализа берут 0,1 мл стабилизированной цельной крови. Источник: 52.

Изложенный метод определения глюкозы в биологических жидкостях по цветной реакции с орто-толуидином положен в ос­нову наборов реактивов, реализуемых различными фирмами. В частности, в состав набора реактивов фирмы ЧНПТ «Филист диагностика» (Украина, Днепропетровск) входит раствор трихлор­уксусной кислоты (30 %); орто-толуидиновый реактив (орто-толу­идин, тиомочевина, уксусная кислота); калибровочный раствор глюкозы (5000 мг/л, 27,75 ммоль/л). К наборам заводского приго­товления прилагаются соответствующие инструкции.

Определение глюкозы в безбелковом фильтрате крови по Сомод-жи. Принцип. Метод основан на окислении глюкозы в ще­лочной среде при кипячении с меди сульфатом. При йодометри-ческом определении образовавшаяся закись меди окисляется йо­дом. Последний освобождается подкислением определенного количества йодноватисто-кислого калия и калия йодид, а остав­шийся свободный йод оттитровывается гипосульфитом.

Реактивы: 5 %-ный раствор цинка сульфата. 5 г цинка суль­фата 7-водного растворяют в 95 мл дистиллированной воды;

0,3 моль/л раствор натрия гидроксида. 12 г натрия гидроксида (ч. д. а. или х. ч.) растворяют в 700 мл дистиллированной воды, ох­лаждают и доводят водой до 1 л. Первый и второй реактивы долж­ны нейтрализовать друг друга. Последнее проверяют медленным титрованием с индикатором фенолфталеином;

реактив Сомоджи: меди сульфат 5-водный (ч. д. а., х. ч.) 8 г; на­трия карбонат безводный (ч. д. а., х. ч.) 30 г; калий-натрий винно­кислый 4-водный (сегнетова соль) (ч. д. а.) 30 г; калия йодид (ч. д. а., х. ч.) 5 г; натрия сульфат безводный (ч. д. а., х. ч.) 180 г; раствор 1 моль/л натрия гидроксида (х. ч.) 40 мл; калий йоднова-тистокислый 1 моль/л раствор (35,67 г KIO3, ч. д. а., х. ч. на 1 л) 5—10 мл.

Приготовление реактива. Натрид карбонат и сег-нетову соль растворяют в 200 мл горячей воды, добавляют раствор натрия гидроксида и меди сульфат, перемешивают, после чего ки­пятят для удаления С0₂. Натрид сульфат растворяют в 500 мл го­рячей дистиллированной воды и нагревают до кипения. Оба рас­твора смешивают и добавляют калий йодистый, предварительно растворенный в малом объеме воды. Затем вливают раствор калия йодноватистокислого и после охлаждения доливают водой в мер­ной колбе до 1 л. Через несколько дней раствор фильтруют. Реак­тив рекомендуется держать при комнатной температуре в склянке из темного стекла. Перед употреблением его необходимо немного подогреть и растворить осадок. Приготовленный реактив титруют 0,005 н. раствором гипосульфита. На 1 мл реактива Сомоджи долж­но пойти 1 мл 0,005 н. раствора гипосульфита. Титр раствора Со­моджи доводят раствором калия йодноватистокислого 1 моль/л;

2 н. (1 моль/л) раствор серной кислоты. 56 мл концентрирован­ной серной кислоты (плотность 1,84) доводят водой в мерной кол­бе до 1 л;

0,005 н. раствор натрия тиосульфита (гипосульфита) 5-водного. Готовят перед анализом из 0,1 н. раствора, приготовленного из стандарт-титра (фиксанала);

1 %-ный раствор крахмала, приготовленного в насыщенном рас­творе натрия хлорида;

1 %-ный спиртовый раствор фенолфталеина;

натрий фторид.

Оборудование: сахарные пробирки; водяная баня; мик­робюретки на 5 мл; колбы из термостойкого стекла на 500 и 1000 мл; термос на 3—5 л.

Ход определения. Для исследования используют цель­ную гепаринизированную кровь, стабилизированную фтористым натрием из расчета 5—10 мг/мл. Кровь необходимо по возможнос­ти быстрее доставить в лабораторию в термосе со льдом, где полу­чают безбелковый фильтрат: к 1 части крови добавляют 5 частей дистиллированной воды, 2 части 0,3 моль/л раствора натрия гид­роксида и 2 части 5%-ного раствора цинка сульфата (например, 5 мл крови + 25 мл воды + 10 мл раствора натрия гидроксида + 10 мл 5 %-ного раствора цинка сульфата). Тщательно перемешивают и че­рез 30 мин фильтруют или центрифугируют при 3000 мин^-1 в те­чение 10 мин. Фильтрат (центрифугат) сливают в пробирку и за­крывают пробкой. Хранить можно в холодильнике не более 2—3 дней. Этот фильтрат можно использовать для определения кетоно­вых тел.

В пробирку вносят 5 мл прозрачного фильтрата (центрифугата) крови, 5 мл реактива Сомоджи, тщательно перемешивают и поме­щают на 15 мин (точно) в кипящую водяную баню. Охлаждают до комнатной температуры. После охлаждения содержимое пробирки подкисляют 2,5—3,0 мл 2 н. раствора серной кислоты. Чтобы под-кисление пробы произошло одновременно, рекомендуется добав­лять кислоту быстро, встряхивая пробирку. Затем в пробирку вносят 2—3 капли 1%-ного раствора крахмала, перемешивают. Титруют из микробюретки 0,005 н. раствором гипосульфита до исчезновения синей окраски. Контроль делают как опыт, но вмес­то фильтрата крови берут 5 мл дистиллированной воды. Расчет ведут по формуле

х = (Л - В) • 30,

где х — концентрация глюкозы, мг%; А — количество 0,005 н. раствора гипосульфита, затраченного на титрование контрольной пробы, мл; В— количество 0,005 н. раствора гипосульфита, затраченного на титрование опытной пробы, мл; 30 — коэффициент для пересчета в мг%.

При пересчете мг% в ммоль/л полученную величину умножают на 0,0555. Ошибка метода составляет ±5 %. Источник: 52.

Клиническое значение. Глюкоза — главный источ­ник энергии для клеток организма. На ее долю приходится более 90 % всех низкомолекулярных углеводов.

Относительно постоянный уровень глюкозы в крови поддержи­вается благодаря сахароснижающему свойству инсулина и сахаропо-вышающему свойству адреналина, глюкогона и глюкокортикоидов.

Концентрация глюкозы в венозной крови на 10 % меньше, чем в капиллярной, она быстро снижается благодаря гликолизу. Поэ­тому глюкозу в крови определяют сразу после ее взятия или про­водят осаждение белков трихлоруксусной кислотой непосредс­твенно на ферме или добавляют ингибитор.

Нормативы глюкозы в крови животных приведены в приложе­ниях 4—7.

Снижение сахара в крови (гипогликемия) бывает при кетозе, вто­ричной остеодистрофии, послеродовом парезе, некоторых формах ожирения, токсических поражениях печени. Часто оно следствие недостатка в кормах легкоусвояемых углеводов, большой потреб­ности в глюкозе при высококонцентратном типе кормления, пре­обладании в рационах кислых кормов. К гипогликемии приводят передозировки инсулина.

Повышение сахара в крови (гипергликемия) может быть стойким и непродолжительным — при скармливании скоту больших коли­честв сахаристых кормов, а также при испуге, высокой температу­ре, стрессовом состоянии. Стойкая гипергликемия бывает при са­харном диабете. Однако следует иметь в виду то обстоятельство, что при сахарном диабете, сопровождаемом выраженной глюкозу-рией, содержание глюкозы в крови может быть в пределах нормы. Это обусловлено понижением почечного порога (ослабление реаб-сорбции глюкозы в почечных канальцах).

В моче здоровых животных глюкозу, как правило, не обнаружи­вают. Появление ее в моче (глюкозурия) бывает при сахарном диа­бете, когда уровень глюкозы в крови превышает пороговую концен­трацию. Почечный порог глюкозы в крови у собак 6,66 ммоль/л.

Почечную глюкозурию отмечают при снижении почечного по­рога вследствие дистрофии почечных канальцев даже при нор­мальной концентрации глюкозы в крови. Это так называемый «по­чечный» диабет.

Определение пировиноградной кислоты по модифицированному методу Фреедмана и Хаугена. Принцип. Пировиноградная кислота при добавлении 2,4-динитрофенилгидрозина превращает­ся в 2,4-динитрофенилгидрозон пировиноградной кислоты, кото­рый очищается от примесей гидрозонов и других кетокислот пос­ледовательной экстракцией содовым раствором. 2,4-динитрофенил­гидрозон образует со щелочью соединение коричнево-красного цвета, интенсивность которого определяют на фотометре.

Реактивы: 7,5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты. Го­товят небольшое количество, хранят в холодильнике. Старые рас­творы использовать нецелесообразно;

толуол чистый (перегнанный);

0,1 %-ный раствор 2,4-динитрофенилгидрозина в 2 моль/л рас­творе соляной кислоты. 100 мг 2,4-динитрофенилгидрозина рас­творяют в 100 мл 2 моль/л раствора соляной кислоты. Кислоту до­бавляют небольшими порциями и нагревают на водяной бане до полного растворения 2,4-динитрофенилгидрозина. Раствор филь­труют и хранят в холодильнике в склянке из темного стекла;

10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

10%-ный раствор натрия карбоната;

1,5 моль/л раствор натрия гидроксида;

2 моль/л раствор соляной кислоты;

основной раствор пировиноградной кислоты. 20 мг пировиног­радной кислоты или 25 мг натрия пировинограднокислого раство­ряют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл;

стандартный 1 мг%-ный раствор пировиноградной кислоты. Готовят перед анализом из основного раствора; 5 мл основного рас­твора пировиноградной кислоты или натрия пировиноградно­кислого в мерной колбе доводят дистиллированной водой до 100 мл.

Оборудование: ФЭК; химические пробирки с притертой пробкой; водяная баня.

Ход определения. Осаждение белков крови. Для полу­чения цельной крови в качестве стабилизатора (антикоагулянта) используют натрия фторид из расчета 100 мг на 10 мл крови. 3 мл только что взятой стабилизированной крови вносят в центрифуж­ную пробирку, затем медленно (по каплям) прибавляют 3 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Содержимое про­бирки тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Пробирку помещают на 10 мин в баню со льдом для лучшего осаждения бел­ка, после чего центрифугируют 10 мин при 3000 мин^-1. Надоса-дочную жидкость осторожно сливают в чистую пробирку и ис­пользуют для определения пировиноградной и молочной кислот. Хранят в банке со льдом.

Образование 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кисло­ты. В пробирку с притертой пробкой вносят 1 мл безбелкового фильтрата крови и помещают в водяную баню при температуре 25 "С на 10 мин. Добавляют 0,25 мл 0,1%-ного раствора 2,4-динит-рофенилгидрозина. Пробу выдерживают 10 мин при комнатной тем­пературе (для образования гидрозина пировиноградной кислоты).

Экстракция 2,4-динитрофенилгидрозона пировиноградной кисло­ты. К реакционной смеси добавляют 2 мл толуола, пробирку за­крывают пробкой и содержимое ее тщательно встряхивают в тече­ние 3 мин. Пробу на 10 мин оставляют для расслоения жидкости. После этого осторожно с помощью шприца и пипетки удаляют нижний водяной слой. К толуоловому экстракту добавляют 1,5 мл 10%-ного раствора натрия карбоната и хорошо взбалтывают, снова дают разделиться слоям жидкости. На этом этапе гидрозон пиро­виноградной кислоты переходит в содовый раствор.

Колориметрирование. Из нижнего содового раствора отбирают 1,25 мл, вносят в чистую пробирку, прибавляют 1,25 мл 1,5 моль/л раствора натрия гидроксида. При этом развивается красно-бурая окраска, специфичная для 2,4-динитрофенилгидрозона пирови­ноградной кислоты. Через 20 мин проводят фотометрирование в кювете с толщиной слоя 5 мм при длине волны 465 нм (синий светофильтр) против контроля.

Контроль готовят так же, как опытную пробу, только без крови. В качестве контроля может быть использован 10%-ный раствор трихлоруксусной кислоты.

Параллельно проводят обработку калибровочного раствора пиро­виноградной кислоты или натрия пировинограднокислого, содержа­щего 1 мг% пировиноградной кислоты, так же, как и пробу крови.

Расчет ведут по формуле

где х — количество пировиноградной кислоты на 100 мл крови, мг; А — экстинкция опытной пробы; В — экстинкция калибровочной пробы; 1 — содержание пировиноградной кислоты в стандартной пробе, мг%.

При переводе мг% в мкмоль/л полученную величину умножают на 113,6.

Расчет можно проводить по калибровочной кривой, построен­ной по стандартному раствору пировиноградной кислоты или на­трия (лития) пировинограднокислого и содового раствора. Готовят стандартный раствор, содержащий в 1 мл 50 мкг пировиноградной кислоты. Далее берут 7 пробирок и вносят последовательно 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,6, 0,8 и 1 мл стандартного раствора. В каждую про­бирку добавляют соответственно 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,4 и 0,2 мл дис­тиллированной воды. Затем добавляют последовательно в том же порядке все реактивы, как и в опытную пробу, проводят колори­метрирование и строят калибровочную кривую. Откладывают на оси ординат величину оптической плотности, а на оси абсцисс — соответствующее ей количество пировиноградной кислоты в мкг в 1 мл (т. е. 5, 10, 15, 20, 30, 40 и 50 мкг/мл).

Клиническое значение. Пировиноградная кислота — промежуточный продукт углеводного и белкового обменов. Она тес­но связана с обменом тиамина. Тиамин в форме тиаминдифосфата является коферментом декарбоксилаз, участвующих в окислитель­ном декарбоксилировании пировиноградной кислоты. При недо­статке тиамина в крови и моче повышается концентрация пирови­ноградной кислоты со всеми последующими патологическими яв­лениями. Нормальное содержание пировиноградной кислоты в крови колеблется от 0,6 до 1,7 мг%, или от 68 до 193 мкмоль/л (см. приложение 5). Ее содержание в крови повышается при гипови­таминозе Bi, нарушении окислительно-восстановительных процес­сов в условиях дефицита кислорода, болезнях печени, кетозе и т. д.

Источник: 48.

Определение молочной кислоты по реакции с параоксидифени-лом. Принцип. Из молочной кислоты в присутствии серной, фосфорной кислот и солей меди образуется уксусный альдегид, который, реагируя с параоксидифенилом (С6Н5С6Н4ОН), дает фи-олетово-окрашенные продукты. Реакция очень чувствительная, поэ­тому нужно строго выдерживать все условия выполнения исследова­ния. В пробирку для взятия крови добавляют смесь ЭДТА и натрия фторида. Кровь немедленно охлаждают. Анализ проводят быстро.

Реактивы: концентрированная серная кислота, выдержи­вающая пробу Саваля (х. ч., плотность 1,84), от ее качества зависит возможность выполнения анализа, иногда качество кислоты мож­но улучшить, нагревая ее и по каплям добавляя в нагретую кислоту пероксид водорода;

смесь из 3 г меди сульфата (CaS0₄ • 5Н2О, ч. д. а., х. ч.) и 9 мл орфтофосфорной кислоты (Н3РО4, ч. д. а., х. ч.), через некоторое время должен образоваться гомогенный раствор;

1,5 %-ный раствор параоксидифенила (CgHsCgH^H) в диме-тилформамиде. Растворяют 15 мг параоксидифенила в 1 мл диме-тилформамиде;

5 %-ная трихлоруксусная кислота (0,3 н.).

Ход определения. 0,02 мл крови вносят в 1 мл 5 %-ной трихлоруксусной кислоты.Через несколько минут центрифугиру­ют 15 мин при 3000 мин ^ К 0,2 мл центрифугата прибавляют 0,1 мл смеси медного купороса и ортофосфорной (фосфорной) кислоты и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Энергично встряхивают и точно через 3 мин ставят ровно на 3 мин в кипящую водяную баню, затем еще 3 мин охлаждают в ледяной воде. Добав­ляют 1 каплю раствора параоксидифенила в диметилформамиде, капля должна сразу попасть в центр пробирки. Встряхивают и ос­тавляют стоять 10 мин при комнатной температуре. После этого нагревают на кипящей водяной бане 1,5 мин, охлаждают в воде и фотометрируют при длине волны 565 нм.

Одновременно ставят холостой опыт, в котором вместо безбел­кового фильтрата применяют 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты, и калибровочные пробы, в которые берут растворы ТХУ, содержащие в 0,2 мл 2—20 нмоль молочной кислоты или молочно­кислого лития. Их обрабатывают так же, как опытные. Окраска ка­либровочной пробы, в которой взято 2 нмоля молочной кислоты, соответствует пробе с содержанием 0,5 ммоль/л; соответственно окраска пробы, содержащей 20 нмоль, соответствует концентра­ции 5 ммоль/л.

Источник: 43.

Примечание. Метод определения молочной кислоты по Баркеру и Саммерсону изложен в книге «Клиническая ла­бораторная диагностика в ветеринарии»: Справоч­ник / И. П. Кондрахин, Н. В. Курилов, А. Г. Мала­хов и др. — М.: Агропромиздат, 1985. — С. 88—90.

Клиническое значение. Молочная кислота обра­зуется при распаде гликогена и глюкозы, ее источником также слу­жит пирувит. В норме содержание молочной кислоты у животных колеблется в пределах 0,295—0,760 ммоль/л (см. приложение 5).

Повышение содержания молочной кислоты (гиперлактатемия) от­мечается при ацидозе рубца, поедании животными большого ко­личества свеклы, зеленой массы кукурузы молочно-восковой спе­лости, зерновых злаковых, содержащих много крахмала. Бывает при миоглобинурии, диабете, эндемической остеодистрофии быч­ков, интенсивном их выращивании и откорме, когда болезнь со­провождается ацидозом рубца и всасыванием в кровь большого ко­личества молочной кислоты. Повышение концентрации лактата в крови может быть обусловлено поражением печени, кислородной недостаточностью (гипоксия), чрезмерной физической нагрузкой, местным нарушением кровообращения.

Метод неферментативного определения лактата и пирувата в од­ной пробе крови. Пр и н ц и п. В основу метода определения лак­тата положена способность молочной кислоты превращаться в ацетоальдегид, который дает с гидрохиноном красно-коричневое окрашивание. В щелочной среде пируват с п-диметиламинбен-зальдегида (п-ДБА) образует комплекс желтого цвета.

Условия взятия образца крови, хранения и исследования такие же, как и при определении лактата.

Реактивы: 10%-ный раствор Н2РО3. Хранят не более 3 дней;

25%-ный раствор CUSO4 • 5Н₂0;

10%-ный раствор Q1SO4 • 5Н2О;

Са(ОН)₂ в порошке (ч. д. а.);

концентрированная H2SO4;

20%-ный спиртовой раствор гидрохинона;

раствор п-диметиламинбензальдегида (п-ДБА): 500 г п-ДБА в 60 мл метилсульфоксида, дистиллированная вода до 100 мл;

25%-ный раствор NaOH.

Оборудование: водяные бани на 37 "С и 100 °С; цент­рифуга ОПН-8; спектрофотометр СФ-46; центрифужные пробир­ки; пробирки с притертыми пробками; пипетки.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 6 мл дистиллированной воды и 1 мл взятой крови, 1 мл 10%-ного раствора Н2РО3, хорошо встряхивают и оставляют на 2 мин для осаждения белков. Центрифугируют 5 мин при 2000—3000 мин Прозрачную надосадочную жидкость переносят в чистую центри­фужную пробирку, приливают 1 мл 25%-ного раствора CUSO4 и вносят 0,5 г Са(ОН)₂, тонко растертого до порошка. Стеклянной палочкой перемешивают пробы, пока голубая окраска не перейдет в синюю. Через 30 мин центрифугируют пробу 10 мин при 2000—3000 мин^-1. Полученный безбелковый центрифугат перено­сят в градуированную пробирку для определения коэффициента К измерения объема анализируемого раствора:

л:= r/v,

где V — общий объем анализируемого раствора (кровь, вода, осадители белков и углеводов), мл; v — объем безбелкового и безуглеводного центрифугата, мл.

Для определения пирувата (Р) в центрифужную пробирку вно­сят 1 мл анализируемого раствора (в контроль — 1 мл воды), 3 мл реактива п-ДБА и 1 мл 25%-ного раствора NaOH. Тщательно пе­ремешивают реакционную смесь и помещают в водяную баню при 37 "С на 45 мин.

Во время термостатирования смеси с пируватом параллельно определяют содержание лактата. Для этого в центрифужную про­бирку с притертой пробкой вносят 1 мл прозрачного центрифугата

( в контроль — 1 мл воды), добав­ляют по 0,1 мл 10%-ного раствора C11SO4 и осторожно по стенке приливают по 4 мл концентриро­ванной H₂S04, хорошо закрывают пробкой во избежание испарения образовавшегося в результате ре­акции ацетальдегида. Смесь по­мещают в кипящую водяную ба­ню на 1,5 мин. После кипячения и охлаждения вносят 0,1 мл спир­тового раствора гидрохинона, пере­мешивают, повторно помещают в кипящую водяную баню на 15 мин и охлаждают. Охлажденный рас­твор колориметрируют при длине волны 430 нм против контроля. Содержание лактата рассчитыва­ют по калибровочной кривой с учетом коэффициента К (рис. 2).

По истечении 45 мин термостатирования реакционную смесь с пируватом центрифугируют при 2000—3000 мин^-1 и осторожно пе­реносят надосадочную жидкость в спектрофотометрические кюве­ты для определения оптической плотности анализируемого раство­ра (при 420 нм) против контроля. Концентрацию пирувата рассчи­тывают по калибровочной кривой с учетом коэффициента К.

Для построения калибровочных графиков используют растворы лактата и пирувата с разведением 1 : 8, обрабатывая их аналогично центрифугату. Концентрацию лактата и пирувата в крови рассчи­тывают путем умножения величин, полученных по калибровочным кривым, на коэффициент К.

Источники: 8, 16, 33.

Определение сиаловых кислот в сыворотке крови по реакции с резорцином. Принцип. При добавлении трихлоруксусной кислоты к сыворотке крови и нагревании происходит мягкий гид­ролиз гликопротеидов с отщеплением нейроминовой кислоты, ко­торая затем вступает в реакцию с раствором резорцина в соляной кислоте с образованием хромогена синего цвета.

Реактивы: резорциновый реактив. Реактив готовят в мер­ной колбе на 100 мл. 200 мг резорцина растворяют в 10 мл дистил­лированной воды, добавляют 80 мл концентрированной соляной кислоты (плотность 1,19) и 0,25 мл 0,1 моль/л раствора меди суль­фата, смешивают, объем доводят дистиллированной водой до 100 мл. Реактив можно использовать через 4 ч после приготовле­ния. Годен в течение 1 мес при хранении в холодильнике;

реактив для экстракции. 85 мл бутилацетата смешивают с 15 мл бутилового спирта;

5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты;

основной калибровочный раствор. 50 мг%-ный водный раствор N-ацетилнейраминовой кислоты. 0,5 мг кристаллической N-аце-тилнейраминовой кислоты (мол. масса 309) растворяют в 1 мл воды. 1 мл основного калибровочного раствора содержит 0,5 мг N-ацетил­нейраминовой кислоты.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня.

Ход определения. К0,1мл сыворотки или плазмы крови добавляют 1,9 мл 5%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, пе­ремешивают и помещают в кипящую водяную баню на 7 мин (точ­но). Охлаждают в проточной воде до комнатной температуры, фильтруют через бумажный фильтр. К 0,5 мл прозрачного филь­трата (соответствует 0,025 мл сыворотки) добавляют 0,5 мл дистил­лированной воды. В каждую пробирку вносят по 1 мл резорцино­вого реактива, закрывают стеклянными пробками и помещают на 15 мин в кипящую водяную баню (пробирки закрывают пробками для уменьшения испарения), охлаждают проточной водой, добав­ляют по 3 мл раствора для экстракции, встряхивают, оставляют на 15 мин для расслоения фаз. Верхний окрашенный слой отсасыва­ют и измеряют на ФЭКе при длине волны 575—590 нм (желтый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против контроля.

Контроль. К 1 мл дистиллированной воды прибавляют 1 мл ре­зорцинового реактива, помещают на 15 мин в кипящую водяную баню, охлаждают в проточной воде до комнатной температуры, до­бавляют 3 мл раствора для экстракции, встряхивают, отсасывают верхний слой, который используют в качестве контроля.

Для построения калибровочного графика готовят разведения (рабочий раствор) из основного калибровочного раствора N-аце-тилнейраминовой кислоты (табл. 19).