16. Смеси реактивов для определения билирубина в сыворотке крови

Ингредиент	Опытная проба, мл		Холостая проба, мл
	Общий билирубин	Связанный билирубин
Сыворотка крови (негемолизирован-	0,5	0,5	0,5
ная)
Кофеиновый реактив	1,75	—	1,75
Раствор натрия хлорида	—	1,75	0,25
Диазосмесь	0,25	0,25	—

Для определения связанного билирубина измерение на фото-электроколориметре проводят через 5—10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют на 20 мин, после чего из­меряют на ФЭКе. В дальнейшем окраска не изменяется.

Измерение проводят при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против воды. Из по­казателей, полученных при колориметрировании общего и связан­ного билирубина, вычитают показатель контроля.

Расчет ведут по калибровочному графику. Находят содер­жание общего и связанного билирубина. Для определения уровня непрямого билирубина вычитают из показателя общего его содер­жания показатель прямого билирубина.

Способ 1. Калибровочный график строят по способу Шелон-га—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сы­воротки крови.

Реактивы для построения калибровочного графика. 1. Основной раствор билирубина. Препараты кристаллического билирубина от­личаются по своим свойствам. Не каждый билирубин может быть использован для построения калибровочного графика. Допустим лишь тот билирубин, 1 мг%-ный раствор которого при растворе­нии в хлороформе (для наркоза) при 25 °С дает на спектрофото­метре абсорбцию от 1,01 до 1,07 при длине волны 453 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

В колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина (имеющийся в продаже билирубин является непрямореагирую-щим) в 30—35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия (10,6 г без­водного Na₂C03 доводят до 1 л дистиллированной водой) и хоро­шо перемешивают, не допуская образования пузырьков. Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Ыа₂СОз и несколько раз перемеши­вают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготов­ления. В дальнейшем билирубин окисляется.

2. Рабочий раствор билирубина. К 13,9 мл свежей негемолизи-рованной сыворотки крови добавляют 2 мл свежеприготовленного раствора билирубина и 0,1 мл (4 моль/л) раствора уксусной кисло­ты (25 мл ледяной уксусной кислоты доводят до 100 мл дистилли­рованной водой). Хорошо перемешивают. При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение не­скольких дней. Он содержит на 10 мг% билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора. Чтобы исключить при расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыво­ротке крови, при измерении на ФЭКе из величины экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответству­ющих разведений компенсационной жидкости.

Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготов­ления калибровочного раствора билирубина, 2 мг 0,1 моль/л рас­твора КагСОз и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.

Для построения калибровочного графика готовят ряд разведе­ний с различным содержанием билирубина (табл. 17).