14. Пересчет содержания иммунных белков в сыворотке крови (н. И. Бли­нов), мг/ мл

ЦСТ, ед.	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9
10	8,53	9,60	10,67	11,74	12,81	13,88	14,95	16,02	17,09	19,23
20	20,30	21,37	22,44	23,51	24,56	25,65	26,72	27,79	28,86	29,93
30	31,00	32,07	33,14	24,21	35,28	26,35	37,42	38,49	39,56	40,63
40	41,70	42,77	43,83	44,91	45,98	47,05	48,12	49,19	50,26	51,32

Примечание. Сыворотка крови не должна иметь следов гемоли­за. Пробирки с сывороткой закрывают резиновы­ми пробками. Метод преимущественно использу­ют для определения иммунных белков в крови но­ворожденных животных.

Источники: 9, 29.

Определение белковых фракций в сыворотке крови турбидимет-рическим (нефелометрическим) методом. Принцип. Различные белковые фракции сыворотки крови способны осаждаться фос­фатными растворами определенной концентрации. При этом об­разуется очень мелкая взвесь и раствор мутнеет. По степени мут­ности растворов, устанавливаемой с помощью фотоэлектроколо-риметра, судят о концентрации белков в исследуемой пробе.

Реактивы: основной фосфатный раствор. 33,5 г натрия гид­роксида (ч. д. а., х. ч.) растворяют в 400 мл дистиллированной во­ды, добавляют 226,8 г калия фосфата однозамещенного (КН2РО4, ч. д. а., х. ч.). После растворения охлаждают до комнатной темпе­ратуры и добавляют дистиллированную воду до объема 500 мл;

рабочие фосфатные растворы. В мерные колбы на 100 мл берут 92,4 мл (№ 1), 74,9 мл (№ 2), 58,8 мл (№ 3), 48,7 мл (№ 4) основ­ного фосфатного раствора и доводят объем дистиллированной водой до метки. Тщательно размешивают путем встряхивания. При хране­нии разведенных растворов для предупреждения бактериального за­грязнения добавляют по 1 капле хлороформа на 100 мл раствора.

Оборудование: фотоколориметр; химические пробирки; пипетки на 1, 2, 5, 10 мл, бюретка; мерные колбы на 100 и 500 мл.

Ход определения. На каждую пробу сыворотки крови в штатив устанавливают по 6 пробирок, обозначив их № 0, 1, 2, 3, 4 и 5. В пробирку № 0 вносят 10 мл дистиллированной воды, в пробирки № 1, 2, 3 и 4 — по 5 мл соответствующих рабочих фос­фатных растворов (№ 1—4). В пробирку № 5 вносят 0,5 л сыворот­ки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного фосфатного раствора, закрывают пробкой и перемешивают путем перевертывания ее 5—6 раз. После этого переносят по 0,5 мл смеси в пробирки № 1, 2, 3, 4 и 1 мл в пробирку № 0. Содержимое про­бирок тщательно, но осторожно перемешивают, избегая образова­ния пузырьков воздуха. Через 15 мин определяют на ФЭКе опти­ческую плотность (Е) растворов при красном светофильтре в кю­вете с толщиной слоя 1 см против контроля (проба № 0). Проводят измерение в обратной последовательности — сначала в пробирке № 4, а затем в пробирках № 3, 2 и 1.

Расчет ведут по схеме: Е пробирки № I — Е пробирки № 2= = Е альбуминов; Е пробирки № 2 — Е пробирки №3 = 1' а-глобу-линов; Епробирки № 3 — Епробирки N»4 = £Р-глобулинов; Е про­бирки № 4 = Е у-глобулинов.

Принимая сумму Е альбуминов и Е всех глобулиновых фракций за 100 %, вычисляют содержание каждой фракции в относитель­ных процентах. Зная концентрацию общего белка сыворотки кро­ви, можно произвести пересчет в абсолютные величины.

Пример расчета: Е пробирки № 1 = 0,800; Е пробирки № 2 = = 0,400; £ пробирки № 3 = 0,300; £ пробирки № 4 = 0,200. Тогда i? альбуминов составит 0,800 — 0,400 = 0,400; Е у-глобулинов 0,400 -- 0,300 = 0,100; Е р-глобулинов 0,300 - 0,200 = 0,100; £у-глобули-нов = 0,200.

Относительный процент альбуминов = ' ' ^ = 50 %;

0,800

а- и р-глобулинов = ^Q>¹-^Q"_nn¹⁰⁰ = по 12,5 %;

0,800

у-глобулинов = ⁰^².⁰"..¹⁰⁰ = 25,0 %. 0,800

Для облегчения расчета нулевые знаки в показаниях экстинк-ции не учитывают. Ошибка метода составляет + 4 %. Источники: 32, 52.

Клиническое значение. Альбумин — простой низ­комолекулярный белок (40—70 тыс. дальтон), синтезируется в пе­чени. Основные его функции — связывание воды, обеспечение коллоидно-осмотического (онкотического) давления, транспорт ионов магния, кальция, билирубина, СЖК, стероидных гормонов и других веществ эндогенного и экзогенного происхождения.

Снижение содержания альбумина наблюдается при уменьшении его синтеза, обусловленного поражением печени (гепатит, гепатоз,

цирроз, амилоидоз печени), острой и хронической пневмонией, бронхопневмонией, лейкозом и др.; при недостатке протеина в кормах, плохом его усвоении, больших потерях с мочой (алимен­тарная дистрофия, гипокобальтоз, диарея до наступления обезво­живания).

Увеличение содержания альбуминов встречается очень редко и ча­ще связано с дегидратацией организма.

Из оц-глобулинов в сыворотке крови обнаруживают два белка: сц-антитрипсин и аргликопротеин. а\-Антитрипсин — ингибитор ряда протеаз. Его содержание повышается при механическом пов­реждении тканей и воспалительных заболеваниях. сц-Гликопроте-ин участвует в транспорте прогестерона и тестостерона. Содержа­ние его возрастает при воспалительных процессах, снижается при циррозе печени.

а2-Глобулины содержат а2-макроглобулин, гаптоглобин и церу-лоплазмин. а2-Макроглобулин — цинксодержащий гликопротеин с большой молекулярной массой. Ингибирует протеолитические ферменты трипсин, химотрипсин, тромбин, плазмин и калликре-ин. Содержание его увеличивается при циррозе печени, нефрозе, сахарном диабете, снижается при ревматоидном полиартрите.

Гаптоглобин связывает и транспортирует свободный гемогло­бин А в клетки ретикулоэндотелия. Содержание его снижается при гепатите, гемолитической анемии, увеличивается при острых вос­палительных процессах, сахарном диабете.

Церулоплазмин — медьсодержащий белок, окисляет трехвален­тное железо в двухвалентное. Уровень его растет при остром вос­палительном процессе, холестазе, ревматоидном артрите, снижает­ся при циррозе печени, хроническом гепатите.

Содержание а2-глобулинов в крови здоровых животных незна­чительное.

Р-Глобулины содержат два белка — трансферин и гемопексин. Трансферин участвует в транспорте трехвалентного железа, снижа­ется его содержание при воспалительных процессах. Гемопексин переносит сывороточный гем. Уровень его падает при гемолити­ческой анемии, заболеваниях печени, нефротическом синдроме, повышается — при воспалительном процессе.

у-Глобулины — иммунные белки. Уровень их повышается при инфекционном воспалительном процессе, а также за счет патоло­гических белков — парапротеинов, относящихся к иммуноглобули­нам. Увеличение содержания у-глобулинов, умеренное повышение уровня р-глобулинов при заметном снижении альбуминов присуще гепатиту, токсическому гепатозу, лейкемии, злокачественным но­вообразованиям, воспалению легких и бронхов.

Снижение у-глобулинов отмечают у новорожденных животных при физиологической незрелости иммунной системы, иммунных дефицитах. Гипогаммаглобинемию отмечают при белковом недо­корме, истощении, воздействии на организм радиации.

Выраженное увеличение количества а-глобулинов с умеренным снижением альбуминов характерно для поздней стадии пневмо­нии, хронического эндокардита, холецистита, уроцистита, пиели­та, токсикозов беременности.

Повышение уровня и р-глобулинов при значительном сни­жении количества у-глобулинов бывает при липоидном и амило­идном нефрозе, нефрите, нефросклерозе, токсикозе беременнос­ти, кахексии, злокачественных новообразованиях.

Значительное увеличение содержания у-глобулинов, умеренное увеличение р-глобулинов при заметном снижении количества аль­буминов присуще гепатитам, токсическому гепатозу, кетозу, гемо­литическим процессам, лейкемиям и злокачественным новообра­зованиям кроветворного и лимфатического аппарата.

При циррозе печени, коллагенозе и некоторых других болезнях наблюдают значительное снижение содержания альбуминов и за­метное увеличение у-глобулинов. Для механической желтухи ха­рактерно уменьшение уровня альбуминов и умеренное увеличение содержания 0С2-, р- и у-глобулинов.

Определение мочевины в сыворотке крови по цветной реакции с диацетилмонооксимом. Принцип. Мочевина в кислой среде образует с диацетилмонооксимом в присутствии тиосемикарбози-да и солей железа окрашенное соединение, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию мочевины в сыворотке крови или моче.

Реактивы: трихлоруксусная кислота, 100 г/л;

диацетилмонооксим, 25 г/л воды. Реактив стабилен при хране­нии в темной посуде;

0,25%-ный раствор тиосемикарбозида (или 0,32%-ный раствор тиосемикарбозида гидрохлорида). Реактивы устойчивы при хране­нии в посуде из темного стекла;

серная кислота концентрированная;

85%-ная ортофосфорная кислота;

железа хлорат;

основной раствор железа хлората. 5 г хлорного железа растворя­ют и доводят дистиллированной водой до 100 мл, затем прибавля­ют 1 мл концентрированной серной кислоты;

рабочий раствор железа хлората. 1 мл основного раствора желе­за хлората доводят до 100 мл дистиллированной водой, добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85%-ной орто-фосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Реактив годен в те­чение 2 нед;

цветной реактив. К 30 мл рабочего раствора железа хлората до­бавляют 20 мл дистиллированной воды, 1 мл 2,5%-ного раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 0,25%-ного раствора тиосеми­карбозида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреб­лением;

калибровочный раствор мочевины — 25 мг%. 250 мг мочевины (х. ч.), высушенной в сушильном шкафу при 105 °С до постоянной массы, растворяют в мерной колбе на 1 л дистиллированной во­дой. В качестве растворителя можно использовать 0,2%-ный рас­твор бензойной кислоты (0,2 г кристаллической бензойной кисло­ты растворяют в 100 мл дистиллированной воды при интенсивном помешивании и нагревают на водяной бане). Стандарт, приготов­ленный на растворе бензойной кислоты, более стабилен, чем вод­ный. Оба раствора при работе должны давать небольшие колеба­ния экстинкции на ФЭКе. В ином случае требуется приготовить новый стандартный раствор.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; центрифуга; центрифужные пробирки; алюминиевая фольга.

Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 0,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл сыворотки крови и 1 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Перемешивают и ос­тавляют на 10—20 мин, центрифугируют 15—20 мин при 3000 мин^-1. В чистую пробирку вносят 0,5 мл прозрачной надосадочной жидкос­ти (не взмучивая осадок) и 5 мл цветного реактива. Пробирку за­крывают резиновой пробкой, обернутой алюминиевой фольгой, выдерживают в кипящей водяной бане 20 мин (точно) и затем ох­лаждают в течение 2—3 мин под струей водопроводной воды. Из­мерение проводят на ФЭКе при длине волны 530—560 нм (зеле­ный светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя 1 см не позднее чем через 15 мин после охлаждения.

Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надоса­дочной жидкости берут 0,5 мл дистиллированной воды. Одновре­менно определяют содержание мочевины в стандартной пробе. Стандартную пробу обрабатывают аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл стандартного раствора мочевины.

Расчет проводят по формуле

х=§= -25,

где х — концентрация мочевины в сыворотке крови, мг%; Е_оп — экстинкция опытной пробы; Е„ — экстинкция стандартной пробы; 25 — концентрация мочевины в калибровочном растворе, мг%.

Для перевода мг% в ммоль/л полученную величину умножают на коэффициент 0,1665. Ошибка метода составляет ±4 %. Источник: 43.

Клиническое значение. Мочевина — основной ко­нечный продукт азотистого обмена. Синтезируется главным обра­зом в печени, а у жвачных животных, кроме того, в стенке рубца из азота аммиака, аминокислот и амидов. Непосредственный пред­шественник мочевины в печени — гуанидиновая группировка ами­нокислоты аргинина. На долю мочевины приходится не менее по­ловины остаточного азота крови и 80—83 % мочи.

Мочевина главным образом выделяется почками, у жвачных животных часть ее поступает в преджелудки со слюной, где распа­дается до аммиака и углекислого газа с последующим использова­нием продуктов распада рубцовой микрофлорой. Концентрация мочевины в крови у здоровых животных колеблется от 20 до 40 мг% (3,33—6,66 ммоль/л).

Значительное повышение содержания мочевины в крови (уремия) наблюдается при циркуляторной недостаточности почек, при ко­торой нарушается фильтрация в клубочках. Такая патология воз­никает при сердечной недостаточности и дегидратации. Наиболее частые причины уремии — заболевания, при которых поражаются преимущественно почечные клубочки (хронический нефрит), или задержка выделения мочи при мочекаменной болезни, аденоме предстаты и др. Уремией сопровождается почечная недостаточность.

Повышение содержания мочевины в крови наблюдали при ал­калозе рубца, скармливании животным большого количества горо­ха, зеленых бобовых кормов (вико-овсяная смесь, горохо-овсяная смесь). Резкую уремию (до 200 мг%) наблюдают у тяжело больных диспепсией телят (И. П. Кондрахин).

Продукционная гиперазотемия возникает при механических повреждениях тканей, обширных ожогах, лихорадочных состояни­ях, когда идет усиленный распад тканевых белков.

Тяжесть уремии связана не с концентрацией самой мочевины (она малотоксична), а с накоплением токсических производных гуанидина — гуанидинянтарной кислоты, метилгуанидина, гауни-динуксусной и гуанидинпропионовой кислот, которые образуются в организме вследствие нарушения нормального синтеза мочевины из арганина.

Уменьшение содержания мочевины в крови бывает при дли­тельном белковом недокорме, при нарушении мочевинообразова-тельной функции печени, наблюдаемой при кетозе коров.

Определение свободного аминного азота в сыворотке крови по методу Г. А. Узбекова в модификации 3. С. Чулковой. Под свобод­ным аминным азотом (аминазот) понимают азот свободных ами­нокислот сыворотки (плазмы крови). Общий аминный азот крови включает кроме азота свободных аминокислот азот сложных поли­пептидов и белков. Из существующих методов определения сво­бодного аминазота крови наиболее распространены нингидрино-вые, один из которых приведен ниже.

Принцип. Аминокислоты при взаимодействии с нингидри-ном подвергаются окислительному дезаминированию и декарбок-силированию. Нингидрин, восстанавливаясь, вступает в реакцию с продуктами этой реакции — образуется соединение, окрашенное в фиолетовый цвет. Интенсивность окрашивания при определенных условиях пропорциональна количеству свободных аминокислот.

Реактивы: 0,04 моль/л раствор уксусной кислоты — 0,23 мл ледяной уксусной кислоты (СН3СООН) на 100 мл воды; 1 %-ный раствор нингидрина.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; пробирки с меткой на 10 мл.

Ход определения. Исследование проводят поэтапно.

1. Осаждение белков. В центрифужную пробирку вносят 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 мл 0,04 моль/л раствора ледяной уксусной кислоты, закрывают пробкой и помещают в холодную водяную ба­ню, которую доводят до кипения. Пробы прогревают в водяной ба­не в течение 5 мин (с момента закипания). Затем пробирки охлаж­дают и содержимое их фильтруют.

2. Фильтрование. К содержимому пробирки добавляют 1 мл дис­тиллированной воды, перемешивают тонкой стеклянной палочкой и фильтруют через гладкий бумажный фильтр. Пробирку и осадок на фильтре промывают еще 2 раза по 1 мл водой, после чего ос­новной фильтрат и промывные воды объединяют в одну пробирку с меткой на 10 мл.

3. Цветная реакция с нингидрином. К полученному фильтрату добавляют 0,5 мл 1%-ного водного раствора нингидрина, содержи­мое пробирки перемешивают и помещают в кипящую водяную ба­ню на 20 мин. Затем пробирку охлаждают в водопроводной воде, оставляют стоять 5 мин при комнатной температуре и доводят объ­ем дистиллированной водой до 10 мл (по метке на пробирке). Од­новременно ставят контроль на реактивы. К 3 мл дистиллирован­ной воды добавляют 0,5 мл 0,04 моль/л раствора ледяной уксусной кислоты, 0,5 мл 1%-ного водного раствора нингидрина, перемеши­вают, прогревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, ох­лаждают под струей водопроводной воды и доводят дистиллиро­ванной водой до 10 мл. В качестве контроля можно пользоваться обычной дистиллированной водой.

4. Колориметрия. Оптическую плотность пробы измеряют на ФЭКе при длине волны 536 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 5 мм против контроля или дистиллированной воды.

Расчет. По калибровочной кривой, построенной по азоту аланина или другой какой-либо аминокислоты с известным содер­жанием азота (кроме триптофана, лизина, цистина), находят коли­чество мкг азота, соответствующее полученным значениям экстинк-ций.

Для перевода в мг% найденный результат умножают на 200 и делят на 1000, т. е. умножают на 0,2 (в случае, если берут 0,5 мл сы­воротки).

Пример: экстинкция пробы составляет 0,212, а количество азота, найденное по калибровочной кривой, — 16,42 мкг. Отсюда концент­рация аминного азота представляет величину 16,42 • 0,2 = 3,284 мг% аминного азота.

Аналогичный результат можно получить при следующей про­порции:

0,5 мл сыворотки — 16,42 мкг 100 мл сыворотки — х,

х = (16,42 • 100) : 0,5 = 3284 мкг% = 3,284 мг%.

Клиническое значение. У здоровых животных в сыворотке (плазме) крови содержится от 4 до 8 мг% свободного аминного азота.

Снижается количество аминного азота при длительном недо­корме, голодании, нефрозе, хронических расстройствах функций желудочно-кишечного тракта, при жировой дистрофии печени вследствие кетоза.

Повышается уровень аминного азота в крови после приема богато­го протеином корма, острой токсической дистрофии печени (пече­ночной коме), отравлении фосфором и другими ядами, лихорадке.

Источник: 32.

Определение мочевой кислоты в сыворотке крови по реакции с фосфорно-вольфрамовым реактивом. Для определения мочевой кислоты в сыворотке крови используют колориметрические, энзи-матические и другие методы. Наиболее специфичные и точные — ферментативные (уреазные) методы, однако их выполнение за­труднительно, поэтому в качестве унифицированного метода в клинико-диагностических целях используется фосфорно-вольфра-мовый карбонатный метод.

Принцип. Мочевая кислота восстанавливает фосфор-но-вольфрамовый реактив с образованием соединения голубого цвета. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевой кислоты.

Реактивы: серная кислота (ч. д. а., х. ч.), 0,35 моль/л. К 200 мл дистиллированной воды добавляют 10 мл концентриро­ванной серной кислоты (плотность 1,84) и доводят объем водой до 500 мл;

натрий вольфрамовокислый двухводный (Na2W0₄ • 2Н2О, ч. д. а.), 100 г/л. Растворяют 50,0 г вольфрамовокислого натрия в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем до 500 мл;

натрия карбонат (Na2C03, ч. д. а.), 103 г/л. Растворяют 51,5 г натрия карбоната в небольшом количестве дистиллированной во­ды и доводят объем до 500 мл;

85%-ная ортофосфорная кислота (ч. д. а.);

лития сульфат (U2SO4 • Н₂0, ч. д. а.);

лития карбонат (1л₂СОз, ч. д. а.);

фосфорно-вольфрамовый реактив. В круглодонную колбу вмес­тимостью 1,5 л вносят 40,0 г вольфрамовокислого натрия и 300 мл дистиллированной воды. Добавляют 32 мл 85%-ной ортофосфор-ной кислоты и несколько стеклянных бусинок. Осторожно кипя­тят в течение 2 ч на песочной или глицериновой бане с обратным холодильником. Охлаждают до комнатной температуры и долива­ют дистиллированной водой до 1 л. Добавляют 32,0 г лития суль­фата. Раствор стабилен при хранении в холодильнике;

мочевая кислота (имп.);

формалин, не менее 37,5 % формальдегида;

основной калибровочный раствор мочевой кислоты, 6 ммоль/л. Растворяют 0,6 г карбоната лития в 150 мл дистиллированной во­ды, фильтруют и нагревают до 60 "С. Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в предварительно нагретую мерную колбу вмести­мостью 1 л, вливают теплый раствор лития карбоната и быстро встряхивают. После растворения мочевой кислоты колбу охлажда­ют до комнатной температуры, добавляют 20 мл раствора форма­лина, наливают 300—350 мл дистиллированной воды. Добавляют несколько капель раствора метилового оранжевого, затем встряхи­вают, медленно добавляют 20—22 мл 0,35 моль/л серной кислоты до появления розового цвета. Доливают колбу до метки дистилли­рованной водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла. 1 мл раствора содержит 0,006 ммоль/1 мг мочевой кислоты;

рабочий калибровочный раствор мочевой кислоты, 0,3 ммоль/л. 5 мл основного калибровочного раствора в мерной колбе доводят до 100 мл дистиллированной водой. Стабилен в течение 2 нед при хранении в холодильнике.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; баня песочная или глицериновая; обратный холодильник.

Ход определения. Опытная проба. К 8 мл дистиллиро­ванной воды прибавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл 0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают. Добавляют 0,5 мл раствора вольфрамово-кислого натрия и тщательно перемешивают. Через 5—10 мин филь­труют. К 3 мл фильтрата добавляют 1,5 мл раствора натрия карбона­та, перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива, перемешивают, переворачивая пробирку. Через 30 мин из­меряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 590—700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба. Ставят так же, как опытную, но вместо филь­трата берут 3 мл дистиллированной воды.

Калибровочная проба. Ставят и измеряют так же, как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл рабочего калибровочного раствора с содержанием 0,3 ммоль/л мочевой кислоты.

где Е_0П — экстинкция опытной пробы; Е_к — экстинкция калибровочной пробы; С_к — концентрация рабочего калибровочного раствора, содержащего 0,3 ммоль/л мочевой кислоты, ммоль/л.

Концентрация мочевой кислоты (х) в ммоль/л составит

При пересчете ммоль/л в мг% полученную величину делят на 0,059 или умножают на 16,94.

Например, найденная величина мочевой кислоты составила 0,24 ммоль/л, это будет соответственно 4,06 мг%.

Источник: 55.

Определение мочевой кислоты в сыворотке крови животных с ис­пользованием заводского набора реактивов. Принцип. Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив с обра­зованием комплекса голубого цвета. Интенсивность окраски про­порциональна концентрации мочевой кислоты.

Реактивы: раствор натрия вольфрамата 10 %-ный; реактив Фолина; раствор натрия карбоната; раствор калибровочный моче­вой кислоты 0,3 ммоль/л; раствор серной кислоты 0,35 моль/л.

Оборудование: фотоэлектроколориметр; две кюветы с толщиной слоя 1 см; пипетки; шприц для отбора центрифугата; центрифуга.

Ход определения. Опытная проба. К 5 мл дистилли­рованной воды добавляют 0,4 мл сыворотки, 0,2 мл раствора сер­ной кислоты, перемешивают. Затем добавляют 0,2 мл раствора на­трия вольфрамата, перемешивают и через 10 мин центрифугируют при 3000 мин^-1 15 мин. Отбирают 3 мл центрифугата, последова­тельно добавляют 0,6 мл натрия карбоната и 0,4 мл реактива Фоли­на, перемешивают и через 30 мин фотометрируют в кювете с тол­щиной слоя 1 см против холостой пробы при длине волны 670 нм.

Холостая проба. К 3 мл воды добавляют 0,2 мл раствора серной кислоты, 0,2 мл натрия вольфрамата, 0,6 мл раствора карбоната натрия и 0,4 мл реактива Фолина.

Калибровочная проба. К 5 мл воды добавляют 0,4 мл калибровоч­ного раствора мочевой кислоты, 0,2 мл раствора серной кислоты, 0,2 мл раствора натрия вольфрамата, перемешивают. Через 10 мин отбирают 3 мл и прибавляют 0,6 мл раствора натрия карбоната и 0,4 мл реактива Фолина. Через 30 мин фотометрируют при тех же условиях, что и опытную пробу.

Концентрация мочевой кислоты в сыворотке крови (х, ммоль/л, л) составит

*= §2-0,3,

где Ео_П — экстинкция опытной пробы; Е_к — экстинкция калибровочной пробы; 0,3 — концентрация мочевой кислоты в калибровочном растворе, ммоль/л.

При переводе в мг% полученную величину в ммоль/л умножают на 16,94.

Источник: 43.

Клиническое значение. Мочевая кислота у птиц, а также у человека является конечным продуктом обмена пурино-вых нуклеиновых оснований, у лошадей, собак и кроликов она окисляется с образованием алантоина. Мочевая кислота плохо растворима в воде, ее соли — ураты откладываются на висцераль­ных оболочках брюшины, внутренних органов, в суставах и моче-выводящих путях, вызывая мочекислый диатез, а при отложении в суставах — подагру. Мочекислый диатез и подагра преимуществен­но встречаются у птиц и человека.

В норме мочевой кислоты у кур содержится 0,23—0,47 ммоль/л, или 4—8 мг/100 мл мочевой кислоты. Повышение ее уровня в сыво­ротке крови у кур отмечается при избыточном протеиновом и ами­нокислотном кормлении, избытке нитратов, недостатке витамина А и др.

Определение креатинина в сыворотке крови по цветной реакции Яффе (метод Лоппера). Принцип. Креатинин реагирует с пик­риновой кислотой в щелочной среде с образованием окрашенных соединений. Интенсивность окраски пропорциональна концент­рации креатинина.

Реактивы: насыщенный раствор пикриновой кислоты. Влажность товарной пикриновой кислоты 15—20 %. Кислоту не су­шат! Взрывоопасна! 2 г пикриновой кислоты растворяют в 100 мл горячей (70—80 °С) дистиллированной воды при нагревании в во­дяной бане. Раствор оставляют стоять на 24 ч, периодически пере­мешивая, затем фильтруют. Реактив стоек. Хранят в темной посуде;

0,1 моль/л НС1;

основной калибровочный раствор креатинина, 10 моль/л: 113 мг креатинина доводят до 100 мл 0,1 моль/л раствором НС1. Хранят в холодильнике в посуде с притертой пробкой. Рабочий ка­либровочный раствор получают разведением основного калибро­вочного раствора дистиллированной водой в 100 раз. 1 мл раствора содержит 0,1 ммоль/л (1 мг%) креатинина;

натрия гидроксид, 2,5 моль/л (10%-ный раствор).

Оборудование: фотоэлектроколориметр; водяная баня; колбы мерные.

Ход определения. Опытная проба. 2,0 мл сыворотки смешивают с 6,0 мл насыщенного раствора пикриновой кислоты. Через 5 мин пробирку помещают на 15—20 с в кипящую водяную баню, затем центрифугируют или фильтруют. К 4 мл центрифугата добавляют 0,2 мл 2,5 моль/л раствора натрия гидроксида и тща­тельно перемешивают. Иногда после подщелачивания раствор мутнеет вследствие выпадения фосфатов. В этом случае его следует еще раз отцентрифугировать. Затем раствор доводят до объема 10 мл дистиллированной водой. Через 10 мин (не позже) измеряют на ФЭКе в кювете с толщиной слоя 2 см при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы.

Холостая проба. 3 мл насыщенного раствора пикриновой кисло­ты и 0,2 мл 2,5 ммоль/л раствора натрия гидроксида доводят до объема 10 мл водой.

Калибровочную пробу обрабатывают точно так же, как и опытную, но вместо сыворотки крови берут 2 мл рабочего 0,1 ммоль/л (1 мг%) раствора креатинина; пробу при этом не центрифугируют. Можно строить калибровочный график. Из рабочего калибровочного рас­твора креатинина готовят разведения, как указано в таблице 15.