Методические указания к практическому заданию 30

Метод определения гиалуронидазы

Готовится гиалуроновая кислота из пупочных канатиков. Для этого свежие пупочные канатики очищаются от крови, разрезаются, освобождаются от сосудов, измельчаются ножницами, взвешиваются, заливаются двойным количеством воды и варятся до оседания кусочков на дно (до кипения не доводить). Раствор пропускают через марлевый фильтр. Фильтрат является гиалуроновой кислотой.

2-миллиардная взвесь суточной агаровой культуры бактерий разливается в пробирки, добавляется рабочее количество гиалуроновой кислоты. Объем жидкости доводят до 1 мл физратвором. Добавляется по 3 капли 15 %-й уксусной кислоты. Ингредиенты осторожно смешивают и учитывают результат.

С уксусной кислотой гиалуроновая кислота должна давать сгусток.

Если штамм продуцирует гиалуронидазу высокой активности, муциновый комочек образуется только в шестой пробирке (контроль). В опытных пробирках жидкость будет равномерно мутной. Если активность фермента невелика, то образование сгустка наблюдается только в первых 2 или 3 пробирках. При отрицательной реакции во всех пробирках образуются сгустки.

Задание 31. Определение нейраминидазной активности микробов:

• культуральную жидкость 72-часовой бульонной культуры синегнойной палочки залить по 0,2 мл в пробирки, добавить по 0,4 мл смеси овомуцина (яичный белок) пополам с фосфатным буфером 0,1 М рН 6,0;

• после одночасового инкубирования в термостате при t 37 °С в пробирки внести по 0,4 мл 4,0 %-го арсенита Na в 0,5 н растворе серной кислоты. Смесь встряхнуть до исчезновения желтой окраски;

• затем добавить по 0,3 мл 0,1 М раствора тиобарбитуровой кислоты, рН 9,0 и пробирки поместить в кипящую водяную баню на 5–7 мин, охладить на льду и в каждую из них внести по 5 мл бутанола;

• появляющееся интенсивное окрашивание смеси свидетельствует о наличии нейраминидазы;

• сделать заключение по заданию.

Задание 32. Определение проявления действия микробных токсинов:

• демонстрация и определение гемолитического действия, вызываемого стафилококками, стрептококками, кишечной палочкой на кровяном агаре;

• столбнячного, ботулинического экзотоксина на мышах (на таблицах и слайдах);

• сделать заключение по заданию.

Задание 33. Определение лизоцимной активности бактерий:

• взвесь миллиардной суточной культуры Micrococcus 0,2 мл засеить в слой 0,7 %-го питательного агара в чашке Петри;

• на поверхность подсушенного агара (с микрококком) петлей в виде бляшек нанести суточные культуры исследуемых штаммов. На одну чашку засеить до 9 исследуемых штаммов;

• посевы инкубировать в термостате в течение 24 ч при 37 °С;

• учесть наличие зон лизиса микрококка вокруг колонии исследуемой культуры с помощью бинокулярной лупы в мм;

• сделать заключение.

Методические указания к заданию 33

Зону лизиса измеряют окуляр-микрометром, предварительно определив цену деления с помощью объект-микрометра или сантиметровой линейки. Для этого объект-микрометр устанавливают на предметном столике микроскопа. Отмечают число делений объект-микрометра, в которые полностью укладываются число делений окуляр-микрометра и устанавливают величину деления объект-микрометра в мм.

Задание 34. Определить антилизоцимную активность бактерий:

• лизоцим (яичный белок) в количестве 1 мл перемешать с питательным агаром (9 мл) и разлить в стерильные чашки Петри;

• стандартной петлей нанести на равном расстоянии капли приготовленных взвеси исследуемых штаммов (не более 9 бляшек на одну чашку). Чашки инкубировать при 37 °С в течение 24 ч;

• после инкубации культуры обработать парами хлороформа в течение 15–20 мин и проветрить. К 4 мл 0,7 %-го агара, остуженного до 48 °С, добавляют 0,1 мл 10-миллиардной взвеси Microccocus lysodeicticus. Перемешать и залить (вторым слоем) на обработанные чашки с исследуемыми культурами. Посевы инкубировать при 37 °С в течение 24 ч;

• антилизоцимную активность определить по наличию роста микрококка в верхнем слое агара над бляшкой. В контроле (чашки без добавления лизоцима) пронаблюдать сплошной рост микрококка.

Занятие 14

Виды невосприимчивости.

Факторы неспецифической резистентности.

Физико-химическая защита. Иммунобиологическая защита

Студент должен:

• знать:

• этапы развития иммунологии;

• факторы неспецифической (естественной) резистентности организма от инфекции;

• уметь:

• определять и производить учет общей бактерицидной активности кожи, сыворотки крови, комплемента, лизоцима и биологических жидкостей, фагоцитоза, НСТ-теста.

Основные вопросы занятия

1. Защитные механизмы и факторы естественной резистентности.

2. Барьерные и бактерицидные свойства кожи, слизистых оболочек.

3. Определение индекса бактерицидности кожи, кожный дисбиоз.

4. Значение нормальной микрофлоры.

5. Лизоцим, его природа, механизм действия. Методика определения содержания лизоцима в биологических жидкостях. Интерферон.

6. Общая бактерицидная активность сыворотки, метод определения.

7. Комплемент, его свойства, компоненты в естественном иммунитете. Пропердин. Механизм действия.

8. Естественные антитела, природа, значение. Секреторные IgA в защите организма от бактериальных инфекций (местный иммунитет).

9. Роль микрофлоры и антигенов пищи.

10. Фагоцитоз как клеточный фактор иммунитета. Роль И.И. Меч-никова в изучении фагоцитоза. Виды фагоцитирующих клеток, стадии фагоцитоза. Незавершенный фагоцитоз.

11. Таксис бактерий. Хемотаксис. Механизм действия хемотаксических агентов на фагоцитоз.

12. Постановка опыта фагоцитоза. Определение активности, интенсивности и завершенности реакции. Опсоно-фагоцитарная реакция.

13. Особенности биохимии фагоцитов при фагоцитозе.

14. Система интерферона.