2) Культуру e.Coli gal- реципиент.

Опыт проводят на чашках с селективной средой, содержащей галактозу (среда ЭМС с индикатором эозин + метиленовый синий).

Постановка опыта трансдукции:

1. В опытную пробирку вносят 0,9 мл 3-часовой бульонной культуры-реципиента и 0,1 мл фаголизата трансдуцирующего фага «лямбда» в концентрации 10 частиц/мл (множественность инфекции 1,0). Смесь выдерживают при 37 °С в течение 30 мин.

2. Ставят 2 контроля: фаголизата на стерильность и культуры-реципиента, высевая их по 1,0 мл на чашки с селективной ЭМС-средой.

3. После инкубации делают высев 0,1 из опытной пробирки с трансдуцирующей смесью на чашку с селективной ЭМС-средой. Опыт учитывают через 48 ч. В контроле фаголизата рост должен отсутствовать. В контроле культуры-реципиента, не расщепляющей галактозу, микробы должны расти в виде бесцветных колоний. На опытной чашке вырастают окрашенные колонии трансдуктантов на фоне прозрачных, бесцветных колоний культуры-реципиента.

III. Трансформация – изменение свойств бактерий-реципиен-тов под влиянием ДНК, выделенной из бактерий доноров, т.е. непо-средственная передача фрагмента ДНК донора клетке-реципиенту.

Учесть опыт передачи устойчивости к стрептомицину у Bacillus subtilis.

В опыт были взяты:

1) ДНК, полученная из стрептомициноустойчивой культуры-донора;

2) стрептомициночувствительная культура-реципиент (в компетентном состоянии).

Опыт поставлен на чашках с МПА, в который добавлен стрептомицин в количестве 100 ед/мл.

Постановка опыта трансформации:

Культуру компетентных клеток соединяют в равных объемах с ДНК (например, по 0,5 мл). Выдерживают смесь в термостате 30 мин для контакта, после чего проводят высев на чашки с МПА и стрептомицином – по 0,2 мл смеси. Ставят 2 контроля: 1) высев на чашку ДНК; 2) высев стрептомициночувствительной культуры-реципиента.

Опыт учитывают через 24–48 ч. В обоих контролях рост должен отсутствовать, на опытных чашках вырастают колонии трансформантов, которые приобрели признак стрептомициночувствительности.

IV. Плазмиды – внехромосомные генетические структуры бактерий, представляющие собой циркулярные молекулы ДНК, способные к автономной репликации. Плазмиды располагаются в цитоплазме бактериальной клетки, некоторые могут включаться (интегрировать) в хромосому.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Впервые описана в 1985 г. Saiki и соавторами.

Сущность метода:

Это циклический процесс увеличения в геометрической прогрессии копий определенного фрагмента ДНК, протекающий под воздействием термостабильной ДНК-полимеразы и при строго заданных временных и температурных режимах. В качестве затравки для одновременного синтеза комплементарных цепей с противоположных концов матрицы используют 2 олигонуклеотида-праймера, способные специфически гибридизоваться с последовательностями нуклеотидов на противоположных концах 2 цепей участка ДНК.

В ходе повторяющихся циклов:

а) денатурация ДНК (температурный или щелочной гидролиз);

б) отжиг праймеров;

в) синтез ДНК-нитей, комплементарных матрице, ограниченной праймерами, цепей с помощью ДНК-полимеразы. Экспоненциально увеличивается количество дискретного фрагмента, фланкированного последовательностями нуклеотидов, соответствующих первичной структуре праймеров. В результате 30 циклов амплификации на базе одной молекулы ДНК можно получить более 1 млн копий необходимого участка ДНК – количества, достаточного для анализа с помощью других молекулярно-биологических методов (молекулярная гибридизация, гельэлектрофорез в присутствии бромистого этидия и др.)

Метод используется для диагностики многих вирусных инфекций в случаях недостаточного количества исследуемого материала; позволяет выявить нуклеиновые кислоты возбудителя не только из свежего материала, но и из высушенных и даже фиксированных препаратов; при отсутствии в крови АТ или при их недостаточном уровне для проведения серодиагностики.

Например: ПЦР позволяет обнаружить геном ВИЧ, встроенный в геном пораженных лимфоцитов, в случаях невозможности использования серологических методов.

Генная инженерия: клонирование генов

Клонирование генов – это процедура, включающая выделение и амплификацию отдельных генов в реципиентных клетках, про- и эукариотических. Эти клетки, содержащие нужный ген, можно использовать для получения: а) большого количества белка, кодируемого данным геном; б) большого количества самого гена в высокоочищенном виде.

Процесс клонирования генов включает в себя несколько стадий:

1. Получение необходимого гена:

1. путем расщепления геномной ДНК с помощью рестриктаз (эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенном месте);

2. путем химического синтеза только небольших фрагментов ДНК (так как зная последовательность аминокислотных остатков в белковой молекуле, можно всегда определить последовательность нуклеотидов в фрагменте ДНК, кодирующем данный белок, в соответствии с генетическим кодом). Так, путем химического синтеза был получен ген, ответственный за синтез соматостатина;

3. из клеток организма выделяют молекулы иРНК и с помощью фермента обратной транскриптазы (РНК-зависимая ДНК-по-лимераза) снимают ДНК-копии необходимого гена. Например, из островных клеток поджелудочной железы были выделены иРНК, несущие информацию о синтезе инсулина. А из клеток, инфицированных вирусами, выделены и РНК, несущие информацию о синтезе интерферона.

2. Ввод выделенного или полученного фрагмента ДНК в состав векторной молекулы ДНК – получение рекомбинантной ДНК. Вектор – это нечто вроде молекулярного «такси», способного переносить чужую ДНК внутрь бактериальной клетки таким образом, чтобы она могла там реплицироваться. Существует два основных типа векторов: бактериальные плазмиды (чаще ответственные за устойчивость к двум и более антибиотикам) и умеренные дефектные (способные к осуществлению трансдукции) бактериофаги.

Плазмиду расщепляют с помощью рестриктазы в сторого определенном месте. После расщепления ее концы, как и концы выделенной для клонирования ДНК, с помощью концевой трансферазы «доращивают» так, чтобы концевые участки плазмиды были комплементарны встраиваемой ДНК (или еще говорят «липкими»). Далее, благодаря взаимодействию «липких» последовательностей и с помощью специальных ферментов ДНК-лигаз осуществляют сшивку (лигирование) ДНК-вставки и плазмидной ДНК. Полученная в результате новая кольцевая молекула ДНК называется уже рекомбинантной ДНК.

3. Ввод рекомбинантной ДНК в состав клетки-реципиента. Клетки, выбранные для клонирования генов могут быть как про-, так и эукариотическими. Чаще всего для этой цели используют бактерии, поскольку их культивирование не представляет большой проблемы (E. coli, В. subtilis и др.). Но если ген выделен по методике 1, то его необходимо клонировать в клетках эукариотов, например, дрожжей. Ввод рекомбинантной ДНК осуществляют путем трансформации (проницаемость клеточной стенки бактерий увеличивается в разбавленном растворе хлористого кальция) или трансдукции (в случае использования в качестве вектора бактериофага).

4. Отбор трансформированных бактерий. Поскольку не все бактериальные клетки в реакционной смеси будут трансформированы, необходимо произвести отбор клеток, содержащих рекомбинантные бактерии. Отбор обычно основан на том, что плазмиды обеспечивают резистентность к тем или иным антибиотикам, а следовательно, бактерии, содержащие плазмиды, будут размножаться в присутствии соответствующего антибиотика.

5. Культивирование трансформированных клеток. Культивирование отобранных клеток необходимо для наращивания биомассы с целью амплификации генов в клетках-реципиентах.

6. Выделение белкового продукта гена или выделение встроенной ДНК из очищенных плазмид.

Получение моноклональных антител (МКА)

Основные методы современной клеточной инженерии – гибридизация (или фузия) и реконструкция клеток. Метод гибридизации клеток позволяет соединить воедино клетки даже совершенно различных микроорганизмов, а также клетки растений, животных и человека.

Фузия клеток осуществляется либо обработкой клеток полиэтиленгликолем, либо действием коротких электрических импульсов. Полученные в результате гибридные клетки – гибридомы – имеют два набора хромосом и сочетают в себе свойства обеих «родительских» клеток.

В 1974 г. Милстайн и Келлер осуществили гибридизацию нормальных лимфоцитов из селезенки иммунизированной мыши с миеломными клетками мыши. Продукт слияния антителопродуцирующих клеток с опухолевыми – гибридома, продуцирующая антитела одной специфичности (к одной антигенной детерминанте) и способная к неограниченному росту in vitro.

МКА широко используются для диагностики многих бактериальных и вирусных инфекций (гепатит В, грипп, герпес, бруцеллез); определения тканевых антигенов, рецепторов и медиаторов лимфоцитов; для диагностики и лечения злокачественных опухолей (созданы МКА, реагирующие со специфическими Аг рака легких, молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы).

Темы докладов для учебной конференции

1. История развития биотехнологии.

2. Биотехнология и разрешение экологических проблем.

3. Биотехнология: новые возможности в диагностике и лечении.

4. Новые лечебные препараты.

5. Возможности и перспективы генной инженерии.