Методы культивирования анаэробных микробов

Анаэробные условия для выращивания анаэробных микро­организмов можно создавать физическими, химическими и био­логическими методами.

1. Физические методы:

• создание вакуума в специальных аппаратах (анаэростат);

• замена воздуха индифферентным газом (анаэростат);

• затруднение доступа кислорода (культивирование в глу­бине столбика агара на среде Вильсона-Блера № 1 – метод Вейнберга или в запаянных стеклянных трубках с агаром – ме­тод Виньяль-Вейона).

2. Химические методы:

• культивирование на плотных питательных средах в спе­циальных аппаратах, в которых кислород поглощается химиче­скими веществами (аппарат Аристовского, эксикатор):

• культивирование в жидких средах в присутствии редуци­рующих веществ (аскорбиновая кислота, тиогликолевая кислота и др.).

3. Биологические методы:

• культивирование па плотных питательных средах в гер­метически закупоренных чашках Петри, в которых кислород по­глощается специально засеянным аэробом (метод Фортнера):

• культивирование в жидких средах, содержащих адсор­бенты для кислорода (кусочки паренхиматозных органов - сре­да Китта-Тароцци, вату и пр.).

В качестве субстрата дыхания в среды для выращивания анаэробов добавляется глюкоза.

Применяемые для культивирования анаэробов среды долж­ны перед засевом подвергаться регенерированию (т.е. освобож­дению от растворенного кислорода) путем кипячения в водяной бане в течение 20-30 минут с последующим быстрым охлажде­нием. После засева жидкие среды заливаются слоем стерильного вазелинового масла.

Для выделения чистых культур анаэробов из смеси с аэроб­ными микробами засевают исследуемый материал на обогати­тельную среду (Китта-Тароцци и др.). Если искомые микробы яв­ляются спороносными, то можно прогревать засеянные пробир­ки при 80°С для уничтожения сопутствующей аспорогенной флоры. После суточной инкубации в термостате делают высев на чашки с плотными питательными средами и помещают их затем в анаэростат или в высокий столбик агара в узких пробирках (метод Вейнберга) для получения отдельных колоний анаэробов.

Самостоятельная работа студента на практическом занятии по теме: «Бактериологический анализ, культивирование анаэробов»

Последовательность действий (этапы)	Способы действия (ориентиры)
I. Методы культивиро­вания анаэробов	Ознакомиться с анаэробным эксика­тором, с характером роста на средах Китта-Тароцци, Вильсона-Блера, в агаре столбиком. Ознакомиться по демонстрационным посевам с методом выделения чистых культур анаэробов: по Цейслеру, Вейнбергу, Фортнеру.
II. Выделение чистых культур анаэробов (I – II этапы)	Разобрать и записать в дневник I этап выделения чистой культуры анаэро­бов. Со среды Китта-Тароцци приготовить мазок, окрасить по Граму, микроскопировать, зарисовать, сделать вы­вод – к какому семейству принадле­жат бактерии. Произвести посев со среды Китта-Тароцци по методу Вейнберга с после­дующим заполнением агаром трубок Вейон-Виньяла. Записать в дневник, обосновав цель посева.
III. Выделение чистой культуры анаэробов (III этап)	Наметить план исследования II этапа. Изучить и описать выросшие на чаш­ке колонии; для оценки правильности методики посева чашку показать пре­подавателю. Отметить колонии, принадлежащие к разным видам бактерий, приготовить из них мазки, окрасить по Граму, микроскопировать и зарисовать. Произвести пересев одной из колоний на косой агар.

Оформление альбома:

• записать в виде таблицы схему описания колоний;

• зарисовать пробирки, демонстрирующие характер роста на жидких средах и пигментообразующие бактерии.

Тема: «Ферменты бактерий. Биохимическая активность микробов, бактериологический метод исследования (продолжение)»

Цель:

– освоить бактериологический метод иссле­дования.

Задачи:

– овладеть навыками идентификации чистой культуры

микроорганизмов;

– уметь определять сахаролитическую, протеолитическую активность

и редуцирующую способность микроорганизмов, правильно

оценивать полученные результаты.

В основе метаболических реакций, протекающих в клетке, лежит деятельность ферментов – особых белков, которые явля­ются биокатализаторами. Ферменты обеспечивают протекание реакции в физиологических условиях Микробы синтезируют разнообразные ферменты.

Эндоферменты — функционируют в клетке и находятся и цитоплазме.

Экзоферменты — выделяются в окружающую среду.

Конституционные ферменты — постоянно присутствуют и клетке в одинаковых концентрациях.

Изучение биохимических свойств бактерий в медицинской микробиологии является одним из основных методов при идентификации вида возбудителя. Особое значение этот метод имеет в диагностике кишечных инфекций (колиэнтеритов, брюшного тифа, сальмонеллезов, дизентерии).

Для биохимической дифференциации выделенной культуры определяются сахаролитические и протеолитические свойства. Для обнаружения этих свойств делают посев на дифференциаль­но-диагностические среды, содержащие вещества, в отношении которых бактерии способны проявлять ферментативную актив­ность.

Таблица 2

Название микроба	Сахаролитические				Протеолитические
	Лактоза	Глюкоза	Мальтоза	Маннит	МПБ			Разжи-жение жела-тины
					Индол	NH3	H2S