- •Розділ 1. Огляд літератури
- •1.1. Вплив іонізуючого випромінювання на живі організми
- •1.2. Радіоіндукований оксидативно-нітративний стрес
- •1.2.1. Надпродукція афо та афн після дії малих доз іонізуючого випромінювання.
- •1.2.2. Роль оксиду нітрогену в розвитку радіоіндукованих порушень
- •1.3. Протекторна дія поліфенольних сполук з виноградних вин у разі розвитку радіоіндукованих уражень.
- •2.1. Умови проведення досліджень
- •2.2. Характеристика об’єкту досліджень
- •2.3. Отримання концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина
- •2.4. Опромінення піддослідних тварин
- •2.5. Забір крові та зразків тканин
- •2.6. Виділення лейкоцитів [10]
- •2.7. Підрахунок кількості лейкоцитів у камері Горяєва [25]
- •2.8. Отримання лізатів лейкоцитів та зразків тканин
- •2.9. Визначення концентрації протеїну за методом Лоурі
- •2.10. Методи дослідження стану системи l-аргінін/оксид нітрогену
- •2.11. Визначення вмісту 3’-нітротирозину
- •2.11.1. Лізис лейкоцитів та зразків тканин для електрофоретичного
- •2.12. Статистична обробка результатів
- •Розділ 3. Результати досліджень
- •3.1. Дослідження ефекту введення концентрату природного поліфенольного комплексу з виноградного вина на стан системи l-аргінін / оксид нітрогену за дії малих доз іонізуючого випромінювання
- •3.2. Вплив поліфенолів з виноградного вина на рівень 3’-нітротирозин-модифікованих протеїнів за дії малих доз іонізуючого випромінювання
- •4. Охорона праці та безпека в надзвичайних ситуаціях
- •Аналіз стану виробничих умов
- •4.1.1. Характеристика лабораторії
- •4.1.2. Аналіз методів дослідження та характеристика обладнання
- •4.1.3. Характеристика об’єкта дослідження, речовин, їхніх небезпечних властивостей
- •Організаційно-технічні заходи
- •4.2.1. Організація робочого місця і роботи
- •4.2.2. Санітарно-гігієнічні вимоги до умов праці
- •4.2.3. Заходи щодо безпеки під час роботи з обладнанням, об’єктом дослідження і речовинами
- •4.3. Безпека в надзвичайних ситуаціях
- •4.3.1. Протипожежні та проти вибухові заходи
- •4.3.2. Організація евакуації працівників
- •Висновки
- •Список використаних джерел
- •Cuttler j. M. Health Effects of Low Level Radiation: When Will We Acknowledge The Reality? / j. M. Cuttler // Dose-Response. – 2007. – Vol. 5. – p. 292–298.
- •Lee j. Autophagy, mitochondria and oxidative stress: cross-talk and redox signalling / j. Lee, s. Giordano, j. Zhang // Biochem. J. – 2012. – Vol. 441. – p. 523–540.
2.9. Визначення концентрації протеїну за методом Лоурі
31
Концентрацію білка визначали згідно зі загальноприйнятим методом Лоурі [137].
Результат виражали у мкг протеїну на 1 мкл.
2.10. Методи дослідження стану системи l-аргінін/оксид нітрогену
2.10.1. Визначення сумарної активності NO-cинтази. Для визначення сумарної активності NOS до відібраного супернатанту з лізатів додавали 10 мМ HEPES буфер, що містив 1 М MgCl2, 1 М СaCl2, 3 мМ L-аргінін та 250 мМ НАДФH+H+. Як контроль використовували проби, що містили повну субстратну суміш та дистильовану воду. Після 30 хвилинної інкубації зразків при 37оС зупиняли реакцію додаванням 96% етилового спирту в пропорції 1:2. Центрифугували 20 хвилин при 3000 об./хв для осадження протеїнів (20оС). В епендорфівські пробірки вносили по 100 мкл супернатанту та 100 мкл реактиву Гріса (який складається з рівних частин 0,05 % розчину N-(1-Нафтил)етилендиамін дигідрохлориду і 1% розчину сульфаніламіду в 5% HCl). Інкубували 30 хвилин при 37оС, після чого переносили зразки у мікропланшети. Вимірювали світлопоглиняння при λ=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США).
Сумарну активність ензиму визначали за різницею утворення нітритів з мінімальною кількістю кофакторів для наближення активності ензиму до вихідного рівня активності в досліджуваних зразках [69]. Активність NOS у пробі виражали в нмолях новоутвореного NО2– за 1 хв на 1 мкг протеїну.
2.10.2. Визначення вмісту нітрит-аніонів. Вміст нітрит-аніону (NO2–) визначали в зразках лізатів клітин з використанням реактиву Гріса. Метод
32
полягає у визначенні інтенсивності забарвлення комплексу солі діазонію, утвореного у результаті реакції NO2– з сульфаніламідом та N(1-нафтил)-етилендіаміном у кислому середовищі.
Депротеїнізацію проводили додаванням до зразків 96% етанолу з наступним центрифугуванням при 3000 об./хв протягом 20 хвилин. У лунки планшети вносили 100 мкл отриманого супернатанту та аналогічний об’єм реактиву Гріса. Абсорбцію вимірювали при λ=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США) після преінкубації при температурі 37°С протягом 30 хв. Контролем слугували проби, які замість зразка містили 100 мкл дистильованої води. Результат розраховували за калібрувальним графіком, який будували з використанням стандартних розчинів нітриту натрію.
2.10.3. Визначення вмісту нітрат-аніонів. Концентрацію нітрат-аніону (NO3–) визначали за різницею між сумарним вмістом стабільних метаболітів оксиду нітрогену та вмістом NO2–.
Депротеїнізацію зразків проводили за схемою, описаною у п. 2.10.2.
Для визначення сумарного вмісту метаболітів NO проводили відновлення нітратів до нітритів, як відновник використовували ванадій (ІІІ) хлорид (VCl3). У лунки планшети вносили 100 мкл супернатанту, додавали однаковий об’єм VCl3, а також швидко вносили 100 мкл реактиву Гріса. Вміст лунки інкубували 30 хв при температурі 37оС. Абсорбцію вимірювали при λ=540 нм на планшетному рідері (Epoch, Biotek, США), у якості контролю використовували проби, які замість зразка містили 100 мкл дистильованої води. Результат розраховували за калібрувальним графіком, який будували із використанням стандартних розчинів нітрату натрію .