Кількісне визначення білірубіну та його фракцій у сироватці крові за методом Ієндрашика, Клеггорна і Грофа

Завдання. Визначити вміст загального, зв’язаного та вільного білірубіну у сироватці крові методом Ієндрашика, Клеггорна і Грофа.

Принцип. Метод базується на здатності зв’язаної і дисоційованої форми вільного білірубіну утворювати при взаємодії з діазофенілсульфо-новою кислотою азобілірубін рожево-фіолетового кольору. Вільний білірубін переводиться в розчинний дисоційований стан кофеїновим реактивом, завдяки чому в цій пробі визначається загальний білірубін. За різницею між загальним і зв’язаним білірубіном знаходять концентрацію вільного.

Хід роботи. У три пробірки вносять, відповідно до таблиці, необхідні інгредієнти і ретельно перемішують.

Реактиви	Загальний білірубін, мл	Зв’язаний білірубін, мл	Контроль, мл
Сироватка	0,5	0,5	0,5
Кофеїновий реактив	1,75	-	1,75
Розчин натрію хлориду (9 г/л)	-	1,75	0,25
Діазореактив	0,25	0,25	-

При визначенні загального білірубіну проби залишають стояти на 20 хв для розвитку забарвлення, а зв’язаного – на 5-10 хв (при більш тривалому стоянні в реакцію вступає вільний білірубін). По закінченні вказаного часу фотометрують кожну пробу проти води на ФЕК при довжині хвилі 520-560 нм (зелений світлофільтр) у 5 мм кюветі. З одержаних екстинкцій загального і зв’язаного білірубіну віднімають екстикцію контрольної проби (контроль на мутність сироватки) і знаходять вміст загального і зв’язаного білірубіну (у мкмоль/л) за калібрувальним графіком. Вільний білірубін розраховують за різницею між кількістю загального і зв’язаного білірубіну. Розраховують вміст загального білірубіну та його фракцій у сироватці крові і роблять висновки про причини можливих відхилень цих показників.

Клініко-діагностичне значення. У нормі вміст загального білірубіну в сироватці крові становить 4,0-21,0 мкмоль/л; з цієї кількості 75% припадає на долю вільного білірубіну (6,0-15,0 мкмоль/л) і 25% на долю зв’язаного (2,0-5,0 мкмоль/л). До основних факторів, що викликають порушення обміну жовчних пігментів, належать: підвищений гемоліз еритроцитів, порушення синтезу білірубінглюкуронідів, порушення виділення зв’язаного білірубіну з гепатоцитів до жовчних капілярів (деструкція гепатоцитів), порушення жовчовиділення внаслідок обтурації позапечінкових жовчовивідних шляхів. Паренхіматозна жовтяниця виникає при гепатитах, цирозах печінки і характеризується різким підвищенням вмісту зв’язаного білірубіну в крові. У печінці знижується утворення білірубінглюкуроніду, внаслідок цього вміст вільного білірубіну в крові також збільшується. Гемолітична жовтяниця виникає при посиленому гемолізі еритроцитів, що призводить до утворення великої кількості вільного білірубіну, оскільки печінка не встигає його зв’язувати. Збільшення концентрації зв’язаного білірубіну у випадку обтураційної жовтяниці обумовлено перенаповненням жовчних шляхів унаслідок закупорки, розриву їх і подальшого переходу компонентів жовчі у кров; при цьому у крові накопичується зв’язаний білірубін (гіпербілірубінемія), із сечі зникає уробіліноген, однак внаслідок білірубінурії вона набуває темного забарвлення, а з калу зникає стеркобілін. У клініко-біохімічних лабораторіях проводять дослідження вмісту білірубіну та його фракцій для диференціальної діагностики жовтяниць.