Свечение при реакциях цепного окисления липидов.

Одна из главных составляющих собственной (неактивированной) хемилюминесценции животных клеток и тканей – свечение, сопровождающее цепное окисление липидов в мембранных структурах клеток и липопротеинах крови. Эта реакция идет с участием свободных радикалов липидов L·и липопероксидов LOO·, которые организуют цепи окисления (рис. 4.13).

Рис. 4.13 Цепь окисления липидов.

Радикалы, ведущие цепь окисления, могут взаимодействовать друг с другом. В реакции взаимодействия двух радикалов липопероксида (LOO·) образуются молекулы кетона и кислорода в электронно-возбужденном состоянии, которые затем переходят в основное состояние, испуская квант света (фотон):

	(4.24)
(420…50 нм)	(4.25)
(1270 нм)	(4.26)
(эксимер кислорода)	(4.27)
(480, 540, 640 нм)	(4.28)

Измерения неактивированной хемилюминесценции используются при изучении механизма цепного окисления липидов в мембранах и липопротеинах плазмы крови. Реакции цепного окисления отличаются большой сложностью и включают в себя целый ряд быстропротекающих стадий. Основные участники реакций свободные радикалы обладают высокой реакционной способностью, неустойчивы в биохимических системах и не поддаются анализу традиционными химическими методами. В то время как измерение хемилюминесценции позволяет оценивать концентрацию липидных радикалов, ведущих цепи окисления. Интенсивность хемилюминесценции при цепном окислении (пероксидации) липидов равна скорости образования фотонов в реакции:

(4.29)

Скорость самой реакции (т.е. число молей продукта, образующегося в секунду) по закону действующих масс равна:

(4.30)

где k – константа скорости реакции взаимодействия радикалов. Следовательно, интенсивность свечения (в числе молей фотонов в секунду) равна:

(4.31)

где – квантовый выход хемилюминесценции.

Таким образом, интенсивность свечения однозначно отражает концентрацию свободных радикалов, ведущих цепи окисления липидов, в каждый данный момент времени, что представляет собой бесценную информацию для анализа механизма реакций на основе измерений кинетики (т.е. временного хода) хемилюминесценции.

Типичная кривая кинетики хемилюминесценции приведена на рис.4.14. На рисунке показаны кривые окисления ионов Fe²⁺ (сплошная линия), а также кривые образования продуктов перекисного окисления липидов: реактивные продукты тиобарбитуровой кислоты ТБКРП (точечная линия) и хемилюминесценции (пунктирная линия) в суспензии митохондрий, к которой добавлены 0,2 мМ Fe²⁺ (момент введения показан стрелкой) [4.6].

Рис. 4.14 Процесс возникновения хемилюминесценции.

Различают несколько стадий процесса ХЛ, каждая из которых характеризуется определенными реакциями цепного процесса пероксидации:

ЛП – латентный период;

МВ – медленная вспышка;

СС – стационарное свечение.

БВ – быстрая вспышка;

Математический анализ такого рода кинетических кривых лежит в основе изучения механизма цепных реакций окисления, отличающихся большой сложностью. В этом опыте к суспензии митохондрий добавляли ионы двухвалентного железа для запуска реакций цепного окисления липидов. Наряду с измерением хемилюминесценции определялось накопление продуктов липидной пероксидации (в данном опыте измерялась концентрация производных малонового диальдегида, MDA) и контролировалось снижение концентрации ионов Fe²⁺, добавленных к суспензии. Вид кинетических кривых отражают сложность самого процесса. В случае Fe²⁺–индуцированной ХЛ в суспензиях мембранных везикул (липосомы, митохондрии, мембраны эндоплазматического ретикулума, клеточные мембраны) кривые ХЛ очень сходны. Из измерений хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов, можно определить основные реакции, приводящие к свечению, а также константы скоростей основных стадий самого процесса цепного окисления липидов в биологических мембранах (стадии инициирования цепей, их продолжения, разветвления или обрыва в присутствии разных антиоксидантов или спонтанно). Для измерения низкоинтенсивного свечения используют высокочувствительные приборы – хемилюминометры. Функциональная схема одного из современных хемилюминометров дана на рис.4.15.

.

Рис.4.15 Принцип работы хемилюминометра.

Основные узлы хемилюминометра:

– светозащитный кожух ящик,

– термостат, в который помещают исследуемую среду,

– высокочувствительный приемник света – фотоэлектронный умножитель (ФЭУ), соединенный через усилитель и другие промежуточные устройства с самопишущим потенциометром или же персональным компьютером.

Исследуемую среду помещаются в термостат, в котором поддерживается определенная температура и осуществляется перемешивание для лучшего снабжения кислородом. Во время эксперимента в термостат вводятся различные добавки и отбираются пробы для химического анализа. Излучение ХЛ регистрируют фотоумножителем, электрический сигнал ФЭУ усиливается, записывается и обрабатывается.

Аналогичную конструкцию используют для изучения свечения изолированных органов, например, перфузируемого легкого или сердца. Добавляя в перфузионную жидкость ингибиторы или активаторы определенных реакций, можно судить о природе химических реакций, сопровождающихся свечением. В результате исследований установлено, что собственное свечение тканей могут вызывать три типа реакций:

– реакции активных форм кислорода;

– реакции цепного (перекисного) окисления липидов;

– реакции с участием окиси азота.

Рис. 4.16 Процесс окисления в НАДФН в мембране фагоцита.

Мембраны фагоцитов содержат ферментативный комплекс НАДФН–оксидазу (рис.4.16), который окисляет НАДФН до НАДФ⁺ за счет восстановления двух молекул кислорода до супероксидного радикала:

НАДФН + 2O2 -> НАДФ+ + 2O2•–

При взаимодействии двух супероксидных радикалов образуется перекись водорода и кислород:

⋅OO¯+⋅OO¯+2Н+ О2 + НООН

Кроме того, фагоцит выделяет в окружающую среду ряд ферментов, среди которых наиболее важный – миелопероксидаза, катализирующий реакцию образования гипохлорита из аниона хлора и перекиси водорода:

⋅Н2 O2¯+Cl¯+2Н+ Н2О + ClО¯

В присутствии ионов металлов переменной валентности, например железа, происходит образование радикалов гидроксила из перекиси водорода (реакция Фентона) и гипохлорита (реакция Осипова).

Можно сделать вывод, что слабое свечение сопровождает все химические реакции, идущие с участием свободных радикалов. Собственное свечение животных клеток и тканей обусловлено преимущественно реакциями цепного окисления липидов и реакциями, сопровождающими взаимодействие окиси азота и супероксидного радикала. При наличии "активаторов", интенсивность свечения клеток и тканей может возрасти на несколько порядков.

Свечение отражает процессы, скорее вредные для организма, т.к. в его основе лежат реакции радикалов, которые обладают способностью разрушать клеточные структуры и приводить к развитию болезней человека.

Свободные радикалы отличаются высокой активностью вступать в химические реакции с выделением большого количества энергии и способностью повреждать молекулы и клетки. В результате развитие многих патологических состояний в живом организме обусловлено участием свободных радикалов кислорода, липидов и белков, а также реакции радикалов с окисью азота. Такие реакции сопровождаются хемилюминесценцией, изучение которой помогает понять механизм этих реакций, и, следовательно, дает возможности для их контроля.

Активаторы ХЛ по механизму действия бывают химическими и физическими.

Химические активаторы ХЛ (ХЛ-зонды), это соединения, вступающие в реакции с АФК или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.

Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние:

Активатор + радикалы → продукт* → продукт + фотон.

Наиболее известны активаторы: люминол (5-амино-1,2,3,4-тетрагидро-1,4-фталазиндион, гидразид 3-аминофталевой кислоты) и люцигенин (динитрат 10,10'‑диметил-9,9'-биакридиния).

Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность ХЛ. В основе их действия лежит физический процесс переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы → продукт* → продукт + фотон 1

(неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор → продукт + активатор* → фотон 2

(активированная ХЛ).

Усиление свечения активатором происходит в том случае, если квантовый выход излучательного перехода (люминесценции) во втором случае выше, чем в первом.

Функциональная схема хемилюминометра.

Дополним схему, изображенную на рис. 4.15 узлами и устройствами, обеспечивающими наблюдение и регистрацию свечения ХЛ. Такая схема представлена на рис. 4.17. На рисунке цифрами обозначены:

1 – блок регулировки температуры;

2 – высоковольтный блок питания;

3 – блок регулировки шторки;

4 – фотоэлектронный умножитель ФЭУ;

5 – аналогово-цифровой преобразователь АЦП;

6 – источник питания прибора ИП

Рис. 4.17 Функциональная схема хемилюминометра.

На рис. 4.18 представлен прибор хемилюминометр ХЛМ-2, изготовленный по функциональной схеме, изображенной на рис. 4.17.

На рис. 4.19 изображен портативный хемилюминофор и кривые хемилюминесценции фагоцитов, приготовленных из моноцитов здорового донора (слева) и больного ишемической болезнью сердца (справа). Стрелками показаны моменты добавки люминола (Л) и стимула ФМА (С). Запись и обработка кривых осуществлена с помощью программы PowerGraph (http://www.powergraph.ru/hard/lum.asp).

Рис. 4.18 Внешний вид стационарного хемилюминометра ХЛМ-2

Рис. 4.19 Портативный хемилюминометр

Литература к разделу 4.

1. Б.И.Давыдов, В.С.Тихончук, В.В.Антипов. Биологическое действие, нормирование и защита от электромагнитных излучений

4.2 Schwan H. P. Electricalcharacteristics of tissue. Biophysik, 1963, 1, p.198-208

4.3 Исимару А. Распространение и рассеяние волн в случайно-неоднородных средах, т.1, издательство «Мир», М., 1981

4.4 Э.Дьелесан, Д.Руайе. Упругие волны в твёрдых телах. Применение для обработки сигналов Пер. с франц. / под ред. В.В. Леманова, - М.Наука Главная редакция физико-математической литературы, 1982 г., 424 с.

4.5 Гурвич А.Г. Митогенетическое излучение, М., Госмедиздат, 1934

6. Владимиров Ю.А. Сверхслабые свечения при биохимических реакциях. М., Наука, 1964.