Биологические методы

Результаты анализа гормонов, выполняемого в различных лабора­ториях, должны выражаться в общепринятых стандартных едини­цах. Результаты биологических исследований приводятся обычно в системе единиц международного стандарта, полу­чаемого из ВОЗ. Эти результаты могут быть выражены и в едини­цах препарата сравнения, получаемого лабораториями из центров, обслуживающих более ограниченные географические области. В таком случае результаты анализа следует сопровождать указанием на способ пересчета единиц препаратов сравнения в единицы международных стандартов. Хотя полипептидные гормо­ны и являются высокоочищенными, но в соответствующих препа­ратах присутствуют небольшие, но влияющие на результаты ана­лиза примеси; поэтому обычно избегают приводить результаты биологических и иных определений в единицах массы гормона. Количество большинства полипептидных гормонов, определяемое с помощью биологических или радиоиммунологических методов, оценивают в системе единиц, ранее установленных ВОЗ. С другой стороны, поскольку стероидные и тиреоидные гормоны существуют в химически чистом виде, результаты их определения обычно вы­ражают в единицах массы. Поскольку в разных лабораториях используют несколько (хотя и существенно) различающиеся реак­тивы и методики, каждая лаборатория должна определять пределы нормальных колебаний концентрации гормонов в пробах, отбирае­мых в стандартных условиях и анализируемых с помощью тща­тельно охарактеризованных реактивов или моделей биологического исследования.

Исследования in vivo

Биологические определения могут выполняться на моделях in vivo или in vitro путем оценки действия постепенно меняющихся доз препарата сравнения или стандарта и интерполяции физиологиче­ского эффекта, вызываемого гормоном, количеством которого в пробе неизвестно. Как правило, в качестве относительно специ­фичного показателя оценивают определенную реакцию, на дейст­вие гормона. Например, сравнивают реакцию массы органа-мише­ни на действие различных доз неизвестного и стандартного гормо­нального препарата. Для того чтобы результаты определения имели силу, кривые доза—реакция для препарата сравнения и не­известной пробы должны быть параллельными. Демонстративным примером служит биологическое определение активности ЛГ и ХГЧ in vivo по влиянию на массу вентральной части предстатель­ной железы. Лютеинизирующий гормон (гормон гипофиза) и ХГЧ (плацентарный гормон) обладают неотличимой биологической активностью. При этом исследовании постепенно увеличивающие­ся количества экстракта мочи вводят подкожно в дробных дозах гипофизэктомированным неполовозрелым самцам крыс на протя­жении нескольких дней и в конце этого периода определяют массу вентральной части предстательной железы. Точно так же вводят постепенно увеличивающиеся дозы препарата сравнения, обладающего известной удельной биологической активностью ЛГ или ХГЧ, и массу вентральной части предстательной железы сравни­вают с таковой у животных, получавших неизвестный препарат. Этот биологический метод адекватен для определения биологиче­ской активности как ЛГ, так и ХГЧ, поскольку оба гормона сти­мулируют синтез и секрецию тестостерона клетками Лейдига крысы, что в свою очередь через ряд биохимических этапов приводит к увеличению размеров вентральной части предстательной железы животного. Увеличение массы этого органа пропорционально коли­честву тестостерона, выделяемого семенниками, стимулированны­ми ЛГ и ХГЧ. Гипофизэктомированных животных используют для того, чтобы исключить синтез и секрецию тестостерона в ответ на эндогенный Л Г. Этот метод является одним из классических и все еще применяется для характеристики препаратов ЛГ и ХГЧ. Он был впервые предложен более 40 лет назад Greep и соавт., а впо­следствии модифицированы [1, 2].

Поскольку наклоны кривой доза-реакция от одного биологиче­ского определения к другому могут значительно варьировать даже при использовании одного и того же препарата, то каждый раз при определении необходимо производить статистический анализ на параллелизм между наклонами и однородностью отклонений кривых доза—реакция для стандарта или препарата сравнения и неизвестного препарата. В идеальном случае следует определить эффект не менее, чем в 3 достаточно отдаленных друг от друга точ­ках кривой доза—реакция с использованием проб от 3—5 животных на каждую точку для стандартного и неизвестного препарата. Только при параллелизме и гомогенности отклонений между стан­дартом и испытуемым препаратом можно сделать достоверный вывод о биологической активности и ее доверительных границах применительно к испытуемому препарату. При отсутствии такого параллелизма об активности испытуемого препарата судить нель­зя. Легко убедиться, что при биологических исследованиях любого типа не должно определяться действие в одной точке.

За многие годы предложено огромное число методов биологиче­ского тестирования in vivo. Некоторые из них достаточно грубы, нечувствительны и неспецифичны, например инсулиновые судоро­ги у мышей. Другие биологические методы значительно более спе­цифичны и чувствительны и продолжают применяться для харак­теристики очищенных гормональных препаратов.