Роль фосфорилирования в эффектах цАмф: протеинкиназы

Вслед за открытием цАМФ и анализом его роли в опосредовании эффектов глюкагона и адреналина на гликолиз было выяснено, что циклический нуклеотид принимает участие в регуляции разнооб­разных метаболических функций. Свидетельством тому служит глобальное присутствие цАМФ у прокариот и эукариот и его учас­тие в реакциях, связанных не только с действием гормонов [4]. Было установлено, что способность цАМФ активировать фосфорилазкиназу в печеночных клетках является общим свойством эукариотических клеток, в которых все эффекты цАМФ реализуются через фосфорилирование белковых субстратов. Подобно цАМФ в эукариотических клетках присутствует фермент, называемый цАМФ-зависимой протеинкиназой, который опосредует эффекты цАМФ на клеточный метаболизм [37]. У прокариот эффекты цАМФ реализуются через другой механизм — взаимодействие цАМФ-связывающих белков с регуляторными участками генома.

В животных тканях цАМФ-зависимая протеинкиназа катали­зирует фосфорилирование многих белковых субстратов, перенося фосфат с АТФ на специфические сериновые (и иногда треониновые) остатки. По данному месту фосфорилируется ряд известных белковых субстратов, в том числе ферменты, такие, как фосфорилазкиназа, гликогенсинтетаза и гормончувствительная липаза, и неферментные клеточные белки, такие, как гистоны, ядерные негистоновые, рибосомные белки, белки микротрубочек и мембран [38]. Большинство субстратов, обладающих ферментативной актив­ностью, существует либо в фосфо-, либо в дефосфоформах, взаимо­превращение которых из активного в неактивное состояние проис­ходит в результате согласованного действия протеинфосфокиназы и фосфопротеинфосфатазы. Протеинфосфокиназы, в том числе цАМФ-зависимая протеинкиназа, переносят -фосфатную группу с АТФ на белковые субстраты, тогда как фосфопротеинфосфатазы катализируют гидролиз фосфопротеинов, отщепляя от них фосфат­ные группы. Этот цикл фосфорилирование—дефосфорилирование считается в настоящее время повсеместно распространенным меха­низмом регуляции метаболизма, причем применительно не только к ферментам, но и к сократительным реакциям, мембранным активностям и ядерным процессам. На функциональном уровне такие эффекты проявляются физиологическими процессами мышечного сокращения, секреции и деятельности нейронов.

Открытие Greengard того факта, что все животные клетки со­держат цАМФ-зависимую протеинкиназу, привело к созданию концепции, согласно которой разнообразные эффекты цАМФ реа­лизуются через этот единственный класс ферментов [39]. С этой точки зрения, специфичность опосредуемых цАМФ реакций опре­деляется характером протеинкиназы и особенно характером белко­вых субстратов, присутствующих в клетках данного типа. Счита­ется, что каждый белковый субстрат контролирует специфический метаболический или физиологический процесс, скорость которого увеличивается или уменьшается при фосфорилировании регуля­торного белка. Способ, с помощью которого фосфорилирование белка опосредует биологические эффекты гормонов и трансмитте­ров, действующих через цАМФ, представлен на рис. 4—12.

Следовало бы полагать, что для катализа фосфорилирования отдельных белковых субстратов при опосредовании многочислен­ных эффектов цАМФ должно существовать множество протеинки­наз. Однако в животных клетках идентифицировано лишь неболь­шое число основных форм этого фермента; поэтому специфичность каждой реакции фосфорилирования должна определяться локали­зацией и характером белкового субстрата. Протеинкиназы широко различаются по своей зависимости или независимости от цикличе­ских нуклеотидов (табл. 4—2).

Рис. 4—12. Общая схема действия пептидного гормона через аденилатцик­лазный и протеинкиназный метаболический путь, предполагающая конт­роль регуляторных белков с помощью фосфорилирования и дефосфорилирования (Greengard [37] в модификации).

Таблица 4—2. Классификация протеинкиназ

1. Ферменты, зависимые и не зависимые от циклических нуклеотидов

2. цАМФ- и цГМФ-зависимые ферменты

3. цАМФ-зависимые ферменты I и II типов

Протеинкиназы, не зависимые от циклических нуклеотидов, при­сутствуют во всех областях клетки и регулируются, по-видимому, другими внутриклеточными сигналами. Недавно обнаруженный класс протеинкиназ для своей активности требует присутствия липидных компонентов мембраны и кальция; ферменты этого клас­са могут быть частью трансмембранных контролирующих систем, регулируемых кальцием. Большинство контролируемых гормона­ми протеинкиназ клеток-мишеней зависит от цАМФ или (реже) от цГМФ. Такие зависимые от циклических нуклеотидов протеин­киназы сосредоточены в цитозоле, по встречаются также в плазма­тических мембранах и в других клеточных органеллах. Они акти­вируются микромолярными концентрациями циклических пурино­вых нуклеотидов (цАМФ и цГМФ) и быстро стимулируются при повышении продукции циклических нуклеотидов в результате дей­ствия гормона на клеточную мембрану. Оба типа зависимых от циклических нуклеотидов протеинкиназ активируются при связы­вании нуклеотида специальным участком фермента. цАМФ-зави­симая протеинкиназа в неактивной форме представляет собой тетрамер, состоящий из субъединиц двух типов: для связывания цАМФ и для катализа переноса фосфата. Неактивный тетрамер состоит из двух связывающих, или регуляторных (Р), субъединиц и двух ферментных, или каталитических (К), субъединиц. При связывании цАМФ с Р2-субъединицами тетрамер Р₂К₂ диссоциирует, высвобождая активные каталитические субъединицы, обла­дающие фосфотрансферазной активностью [38]. Эту реакцию мож­но представить следующим образом:

Р₂К₂ (неактивная) + 4цАМФ  Р2•цАМФ₄ + 2К (активная).

После своего образования свободная К-субъединица обнаружива­ет функциональное сходство с цАМФ-независимыми протеинкина­зами, но ее можно отличить по характерному размеру (молекуляр­ная масса 38000) и реакции на термостабильный ингибиторный белок, который блокирует ее каталитическую активность и пред­отвращает рекомбинацию с регуляторной субъединицей. Каталити­ческие субъединицы, по всей вероятности, едины во всех формах цАМФ-зависимых протеинкиназ, тогда как регуляторные субъеди­ницы обнаруживают индивидуальные особенности. Считается, что регуляторные субъединицы, высвобождающиеся при диссоциации протеинкиназы, остаются в виде Р₂-димера и позднее подвергаются повторной ассоциации со свободными каталитическими субъедини­цами, в результате чего восстанавливается неактивный голофермент. В отсутствии цАМФ регуляторные и каталитические субъ­единицы связаны друг с другом с высоким сродством и в физиоло­гических условиях присутствуют преимущественно в виде неактив­ного голофермента [40]. цГМФ-зависимые протеинкиназы вначале были обнаружены у беспозвоночных, но позднее их нашли и в тканях млекопитающих, где они функционируют иным образом, чем цАМФ-зависимый фер­мент. Их сродство к цАМФ гораздо ниже, чем к цГМФ, а фермен­тативная активность обычно также уступает таковой цАМФ-зави­симого фермента. Активация осуществляется путем связывания цГМФ регуляторным участком фермента, причем считают, что подобно цАМФ-зависимой протеинкиназе этот фермент также диссоциирует с высвобождением активной каталитической единицы. Недавно была установлена гомология между двумя формами зави­симых от циклических нуклеотидов ферментов, что привело к мыс­ли об их общем эволюционном происхождении из примитивной фосфотрансферазы [41].

Растворимые формы цАМФ-зависимой протеинкиназы из тка­ней млекопитающих с помощью ионообменной хроматографии уда­ется разделить на два главных типа (табл. 4—3).

Протеинкиназа I типа имеет менее кислый оптимум, быстро диссоциирует под влиянием субстрата (гистонов) или высокой концентрации соли (0,5 М NaCl) и медленно реассоциирует после вызванной цАМФ диссоциации. Фермент II типа имеет более кис­лый оптимум и медленнее диссоциирует под действием гисто­нов и соли, но быстро реассоциирует, образуя неактивный олигомер. В большинстве тканей присутствуют обе формы протеинкиназ, но их соотношение в клетках разного типа варьирует. Так, в скелетной мышце кролика преобладает фермент I типа, а в сердеч­ной мышце крупного рогатого скота—фермент II типа. Оба голофермента обычно сходны по составу и молекулярной массе субъдиниц: каждая связывает по две молекулы цАМФ, а их катали­тические субъединицы, по всей вероятности, идентичны. Различия касаются молекулярной массы и функции регуляторных субъединиц, причем главное различие заключается в том, что фермент I типа связывает Mg-АТФ, тогда как фермент II типа катализи­рует фосфорилирование своей собственной регуляторной субъеди­ницы за счет АТФ. Связывание АТФ ферментом I типа снижает его сродство к цАМФ и, по-видимому, способствует сохранению неактивного состояния фермента. Субъединица I типа, хотя и свя­зывает АТФ, не фосфорилируется каким бы то ни было фермен­том, что отличается от «аутофосфорилирования», свойственного ферменту II типа [42].

Таблица 4—3. Свойства цАМФ-зависимой протеинкиназы

	Тип I	Тип II
Тканевой источник	Скелетная мышца кро­лика Клетки Лейдига крысы	Сердечная мышца быка Сердечная мышца свиньи Головной мозг быка
Структура субъединиц	Р2К2	P2K2
Молекулярная масса
Голофермент	165 000	174000
Р2	98000	98000
К	38000	38000
Элюция с ДЭАЭ-целлюлозы	0,1 М NaCl	0,2 М NaCl
Диссоциация под дейст­вием соли и гистонов	Быстрая	Медленная
Реассоциация после уда­ления цАМФ	Медленная	Быстрая

Функциональное значение этих двух эффектов на Р-субъединицы не ясно, хотя фосфорилирование ферментов II типа могло бы представлять собой эволюционно более позднюю форму связыва­ния субстрата (АТФ), характерного и для фермента I типа. Фос­форилирование протеинкиназы II типа сопровождается снижени­ем скорости воссоединения диссоциированных Р- и К-субъединиц. Таким образом, фосфорилирование могло бы служить фактором контроля за активностью диссоциированного фермента и регули­ровать скорость восстановления его неактивной формы. Ускорение дефосфорилирования Р-субъединицы должно было бы способство­вать рекомбинации голофермента Р₂К₂, приводящей к высвобож­дению и разрушению цАМФ. Таким способом могла бы осуществ­ляться регуляция соотношения активного и неактивного ферментов в отсутствие изменений концентрации цАМФ. Другая возможность заключается в том, что ферменты II типа, участвующие в быстрых циклах метаболических процессов, что наблюдается в сердечной и нервной тканях, приобрели способность более тонко регулировать­ся (инактивироваться) эффектами этапа фосфорилирования: дефосфорилирование на регуляторную субъединицу по механизму ультракороткой обратной связи.

После установления роли цАМФ-зависимой протеинкиназы в фосфорилировании и активации фосфорилазы киназы было пока­зано, что этот фермент фосфорилирует основные белки, в том чис­ле гистоны, казеин и протамин, как и многие денатурированные белки (такие, как протеин яичного белка, лизоцим и бычий сыво­роточный альбумин), в своем нативном состоянии не являющиеся субстратами фосфорилирования. Небольшие основные пептиды так­же фосфорилируются этим ферментом, как и синтетические пеп­тидные последовательности, сходные с участками фосфорилирова­ния нативных и денатурированных белковых субстратов. Эти дан­ные указывают на то, что реакция фосфорилирования, осущест­вляемая протеинкиназой, является не слишком специфичной в от­ношении аминокислотных последовательностей отдельных белков, но обладает сравнительно высокой специфичностью по отношению к остаткам серина, локализованным в определенных участках пер­вичной аминокислотной последовательности многих белков. При анализе структур, необходимых для фосфорилирования, обнаружи­ли, что пептидные субстраты протеинкиназы обладают двумя близ­ко расположенными основными аминокислотами, одной из которых является аргинин, локализующийся через 2—5 остатков от фосфо­рилируемого серинового остатка на аминоконцевой стороне пеп­тида [43].

В физиологически важных белковых субстратах цАМФ-зависимой протеинкиназы были определены две формы аминокислотной последовательности на участке фосфорилирования

В этих последовательностях на месте Х может стоять любая аминокислота, хотя остатки, располагающиеся в непосредственной близости к серину, обычно имеют гидрофобные боковые цепи. Уча­сток фосфорилирования I типа, где основные аминокислоты отде­лены от серина двумя остатками, присутствует в-субъединице фосфорилазы киназы и в гликогенситетазе. Участок II типа ним промежуточным остатком) присутствует в пируваткиназе и регуляторной субъединице цАМФ-зависимой протеинкиназы II типа. Поскольку скорость фосфорилирования главным образом зависит от сравнительно часто встречающейся первичной последо­вательности на определенном участке пептидной цепи, специфич­ность отдельных белков как субстратов фосфорилирования должна определяться их вторичной и третичной (т. е. трехмерной) кон­формацией, которая может ограничивать присутствие потенциально фосфорилируемых участков для каталитической единицы фер­мента. Предполагаемая роль вторичной структуры в определении субстратной специфичности сводится к положению фосфорилируе­мого серина на гидрофильной поверхности белкового субстрата, в сформированных водородными связями складках-структуры, которая может быть «узнана» протеинкиназой [44].