Циклический амф

Поскольку гормональная стимуляция клеток-мишеней, как прави­ло, имеет прерывистый и преходящий характер, внутриклеточные «вторые медиаторы» должны подвергаться быстрому кругообороту (путем разрушения или поступления в новый цикл) с тем, чтобы повторные и меняющиеся внешние стимулы могли бы превращать­ся в строго соответствующие количественные реакции клетки. Ди­намическое равновесие между образованием и элиминацией цик­лических нуклеотидов контролирует их внутриклеточный уровень в исходном и активированном гормоном состоянии клетки и соз­дает возможность развития быстрых реакций на изменение уровня внеклеточных регуляторов. Эта регуляция опосредуется в основ­ном активацией аденилатциклазы в клеточной мембране, что при­водит к увеличению внутриклеточной концентрации цАМФ. Ско­рость разрушения цАМФ фосфодиэстеразой также является объек­том гормональной регуляции и может влиять на внутриклеточную концентрацию нуклеотида (см. рис. 4—2). Все известные на сего­дня эффекты цАМФ в эукариотических клетках реализуются через превращение неактивной фосфокиназы (протеинкиназы) в актив­ную форму, которая катализирует фосфорилирование специфиче­ских белковых субстратов в клетке-мишени. Таким образом, пони­мание механизма действия пептидных гормонов требует выяснения путей гормональной регуляции активности аденилатциклазы и фосфодиэстеразы, а также путей активации и функций цАМФ-за­висимой протеинкиназы.

Аденилатциклаза и ее регуляция

Открытие цАМФ и аденилатциклазы группой Sutherland было свя­зано с изучением регуляции печеночного гликогенолиза адренали­ном и глюкагоном [4]. Эти исследователи показали, что такие гипергликемизирующие агенты вызывают активацию гликогенфосфорилазы и последующее расщепление гликогена до глюкозофосфатов. Затем было показано, что активация гликогенфосфорилазы зависит от промежуточного этапа (позднее идентифицированного как фос­форилирование под действием протеинкиназы), который стимули­руется термостабильным фактором, образующимся при взаимодей­ствии гормона с нерастворимой фракцией печеночной клетки. Было установлено, что последняя реакция требует АТФ, который в присутствии гормона и иона магния превращается в цАМФ и неорганический фосфат. Далее было показано, что фермент, ответ­ственный за эту реакцию, располагается на внутренней поверхно­сти плазматической мембраны и активируется разными пептидны­ми гормонами (рис. 4—10). Названный первоначально Sutherland аденилциклазой фермент плазматической мембраны впоследствии стали называть аденилатциклазой или аденилилциклазой. Эти термины точнее описывают его специфическое циклизирующее действие на АТФ. Фермент, ответственный за образо­вание цАМФ, следует называть наиболее широко употребительным термином «аденилатциклаза».

Вслед за идентификацией аденилатциклазы в качестве фер­мента, связанного с мембраной, и определением его регуляции со стороны катехоламинов и пептидных гормонов появилось огром­ное число сообщений об участии (или неучастии) цАМФ в гормон-зависимых процессах. Вскоре выяснилось, что способностью акти­вировать аденилатциклазу обладают только пептиды и трансмитте­ры, которые связываются с поверхностью клетки, тогда как другие гормоны, (тироксин и стероиды) не оказывают закономерного дей­ствия на систему аденилатциклаза — цАМФ. Sutherland рассмат­ривал циклазу как фермент, обладающий рецепторной субъедини­цей (местом распознавания пептидных гормонов) и каталитиче­ской субъединицей (превращающей АТФ в цАМФ). Позднее предполагалось, что эти субъединицы существуют в виде отдель­ных структур, плавающих в липидном бислое клеточной мембра­ны и объединяющихся в активную форму при взаимодействии гор­мона с рецепторным местом [10]. Это представление легло в основу двухэтапной теории активации фермента, согласно которой гормонрецепторный комплекс диффундирует по клеточной мембране и взаимодействует с каталитической единицей (активируя ее), расположенной на цитоплазматической поверхности мембраны (см. рис. 4—3).

Рис. 4—10. Активация ранних и поздних реакций в эндокринной клетке-мишени гормонами, стимулирующими аденилатциклазный-протеинкиназный путь. НСБ — нуклеотидсвязывающий белок; Р — рецептор.

Эта относительно простая модель аденилатциклазы впослед­ствии усложнилась, благодаря выяснению роли промежуточного процесса (трансдукции) между гормонрецепторным взаимодейст­вием и изменением конформации каталитической субъединицы, приводящим к активации фермента. Существование и свойства это­го промежуточного (сопрягающего) этапа были продемонстриро­ваны группой Rodbell в процессе изучения глюкагончувствительной аденилатциклазы, присутствующей в плазматических мембра­нах клеток крысиной печени [31]. На этой системе было показано, что гуаниловые нуклеотиды (особенно ГТФ) усиливают активи­рующее действие гормона на аденилатциклазу, а также способст­вуют диссоциации комплекса глюкагона с его рецептором. Иссле­дования Rodbell свидетельствовали о том, что глюкагон облегчает активацию аденилатциклазы гуаниловыми нуклеотидами, а не ока­зывает прямого стимулирующего влияния на фермент. Регулятор­ный участок аденилатциклазы, взаимодействующий с гуаниловым нуклеотидом, идентифицирован в различных эукариотических тка­нях, и предполагается, что он играет фундаментальную роль в дей­ствии пептидных гормонов, катехоламинов и простагландинов.

Последующие эксперименты подтвердили общую зависимость ак­тивирующего аденилатциклазу действия пептидных гормонов от гуаниловых нуклеотидов, причем было подчеркнуто значение свя­зывания ГТФ с регуляторным участком как обязательного этапа гормонального действия [12].

Современная точка зрения на механизм гормональной актива­ции аденилатциклазы в качестве первичного этапа действия пеп­тидного гормона предполагает зависимое от лиганда присоединение ГТФ к регуляторному участку (см. рис. 4—4). Связывание ГТФ с этим промежуточным регуляторным белком превращает неактив­ную каталитическую единицу в ее активную циклизирующую фор­му; процесс активации прекращается при гидролизе связанного ГТФ с образованием ГДФ, и фермент восстанавливает свое исход­ное состояние. В пользу существования такого механизма свиде­тельствуют данные о том, что стимулируемая гормоном активность ГТФазы связана с гуапилнуклеотид-регуляторным участком, а также о способности негидролизуемых аналогов ГТФ (Gpp (NH) p и ГТФS) вызывать выраженную и длительную активацию аде­нилатциклазы. Последний эффект обусловливается резистентно­стью синтетических аналогов к гидролитическому действию ГТФазы, что является причиной персистирующей занятости регу­ляторного участка активным нуклеотидом вместо обычно транзи­торного эффекта связывания ГТФ [32]. Этот механизм лежит и в основе выраженного действия холерного токсина на активность аденилатциклазы с «фиксированием» фермента в постоянно актив­ном состоянии. Указанный феномен зависит от присутствия ГТФ и обусловливается ингибированием токсинов гормонзависимой ГТФазной активности [33]. Этот эффект холерного токсина реали­зуется через стимуляцию переноса АДФ-рибозы (от НАД) на ассо­циированный с аденилатциклазой ГТФ-связывающий белок [34], что приводит к угнетению активности ГТФазы.

Все эти данные позволяют считать, что активность аденилат­циклазы «включается» возникающим под действием гормона свя­зыванием ГТФ в присутствии АТФ как субстрата и «выключает­ся» путем гидролиза ГТФ в регуляторном участке [33] (рис. 4— 11). «Выключение» реакции блокируется нефизиологическими агентами, такими, как Gpp (NH) p и холерный токсин, а также мо­жет служить способом регуляции активности аденилатциклазы другими внутриклеточными сигналами.

Дальнейшие указания на значение регуляторного участка были получены при попытках реконструкции гормончувствительной ак­тивности аденилатциклазы путем слияния клеток или добавления растворимых клеточных экстрактов к комплементарным мембра­нам. В опытах по слиянию клеток гетерокарионы, образуемые из характерных для эритролейкемии клеток крови (лишенных-ре­цепторов) и эритроцитов индюшки (с инактивированной аденил­атциклазой), обнаруживали катехоламинчувствительную циклазную активность, отсутствовавшую в донорских клетках [35]. Подобно этому, рецепторы ЛГ, содержащиеся в богатых липидами экстрактах яичников, были перенесены в клетки сетчатой зоны коры надпочечников, в которой они опосредовали действие гона­дотропинов на продукцию цАМФ и кортикостероидов [6]. В экспе­риментах по реконструкции солюбилизированная детергентом аде­нилатциклаза включалась в состав содержащих рецепторы мем­бран мутантных клеток, дефицитных по аденилатциклазе, с восстановлением стимулируемой катехоламинами активности фер­мента [36]. Подобно упомянутым результатам исследований со сли­янием клеток эти данные подчеркивают пространственную неза­висимость гормональных рецепторов и аденилатциклазы и свиде­тельствуют о способности рецепторов к движению в латеральном направлении и взаимодействию с нуклеотидрегуляторной единицей аденилатциклазы в клеточной мембране. Такие данные свидетель­ствуют о том, что между гормональными рецепторами и компонен­тами аденилатциклазной системы существует общий сопрягающий механизм, проявляющийся при взаимодействии гетеротопных рецепторов и аденилатциклазы клетки-хозяина. Это могло бы ука­зывать на существование области конформационного сходства у всех рецепторов пептидных гормонов при сохранении уникально­сти их областей, ответственных за специфическое связывание гор­монов [36]. Выяснению вопроса о том, действительно ли рецепто­ры пептидных гормонов обладают общим доменом, определяющим возможность взаимодействия с регуляторными компонентами эффекторных мембранных ферментов, должен был бы способство­вать более подробный структурный анализ этих рецепторов.

Рис. 4—11. Роль циклических нуклеотидов в гормональной регуляции аде­нилатциклазы. Гормонрецепторное взаимодействие приводит к связыванию ГТФ регуляторным участком и активации аденилатциклазы. Гидролиз ГТФ до ГДФ, локализованной в этом участке ГТФфазой, восстанавливает не­активную форму фермента. Токсин холерного вибриона (ТХВ) необратимо инактивирует фермент, блокируй активность ГТФазы. Связывание регуля­торным участком негидролизуемых аналогов ГТФ, таких, как Gpp (NH) P, также вызывает длительную активацию фермента (Cassel и соавт. [33] в модификации). Ф_н — фосфор неорганический.

Результаты опытов по реконструкции, проведенные на мутант­ных клетках, обладающих-адренергическими рецепторами и аде­нилатциклазой, которая, хотя и присутствовала, но была «разобщена» (т. е. не реагировала на катехоламины), показали восста­новление стимулируемой катехоламинами активности при добав­лении экстрактов клеток дикого типа. Это свидетельствует о том, что сопрягающий фактор (возможно, нормальная нуклеотидрегуляторная единица), включающийся в мембрану мутантной клетки, замещает предположительно дефектный у таких мутантов регу­ляторный участок [36].

Помимо участия в активации аденилатциклазы, гуаниловые ну­клеотиды часто влияют и на кинетику связывания и сродство гормонрецепторного взаимодействия. Анализ солюбилизированных мембранных систем и раздельных эффектов гуаниловых нуклеоти­дов на связывание гормона и активацию циклазы указывает на структурную и функциональную обособленность участков, влияю­щих на конформацию рецептора и ферментативную активность [32]. Разделенность «рецепторной» и «каталитической» единицы регуляторного белка надежно доказывается результатами этих и более ранних исследований, но вопрос о механизме взаимодейст­вия компонентов реакции остается нерешенным. Важным аспек­том влияния ГТФ на сродство рецепторов к лиганду является спо­собность нуклеотида снижать «прочность» связывания гормона почти с необратимой ассоциации до состояния (в некоторых слу­чаях) с гораздо меньшим сродством. Это наблюдалось в отноше­нии рецепторов глюкагона, а также в отношении связывания ли­гандов-агонистов с-адренергическими рецепторами. В отличие от этого, гуаниловые нуклеотиды не изменяли связывание-антаго­нистов, что указывает на роль сопряжения с аденилатциклазой в способности нуклеотидов повышать диссоциацию связанного с рецептором агониста [20]. Хотя данные, полученные при исследо­вании глюкагоновой системы, свидетельствуют в пользу существо­вания обособленных мест действия нуклеотидов на регуляцию рецепторного связывания и активность аденилатциклазы, однако роль этих мест в гормональной активации и рецепторферментном сопряжении все еще остается не выясненной. Состояние низкого сродства рецептора, вызываемое ГТФ, рассматривается как благо­приятное предшествующее состояние процесса трансмембранного сопряжения, а разобщенная форма рецептора, обладающая высо­ким сродством, могла бы отражать неактивное состояние фермен­та. Последнее могло бы иметь отношение к «десенситизации» аде­нилатциклазы повышенными концентрациями гормона [20].