Глава 6 Перспектива лазерного мутагенезу для селекції рослин

У попередніх розділах обговорювалися генетичні особливості лазерного мутагенезу взагалі і в порівнянні з традиційними мутагенними факторами. Однак у зв'язку з тим, що індукований мутаційний процес відноситься до числа складних біологічних явищ, його характеристика не повинна обмежуватися тільки кількісною оцінкою. З досвіду застосування вже відомих мутагенів з'ясовано, що їх дія на первинні генетичні системи і подальша реалізація виникли змін в процесі росту і розвитку рослин зазнає різні видозміни. Їх характер і полно¬та залежать не тільки від мутагену і факторів середовища, але і від взятого в досвід генотипу. Ретельний науковий аналіз впливу кожного елемента цієї складної системи скрутний. Однак необхідно прагнути до того, щоб більшість з них все ж піддалося вивченню.

Ми досліджували можливість ранньої оцінки мутаційної мінливості при лазерному мутагенезі. Для цього передбачалося провести пошук тестів на рослинах першого опроміненого покоління (МЦ, які б об'єктивно характеризували загальну мутационную мінливість, яка спостерігається звичайно тільки в М2.

Успішне вирішення цього завдання сприятиме значному підвищенню ефективності робіт в області експериментального мутагенезу як щодо строків, так і обсягів посівів рослин в М2.

Зазвичай для отримання достатньої кількості мутантів дослідникам доводиться аналізувати в М2 кілька тисяч рослин. Це складно і непродуктивно. Якщо ж врахувати, що при радіаційному і хімічному мутагенезі в результаті застосування напівлетальних

доз і концентрацій (ЛД-50) половина оброблених рослин гине, то поряд з низькою продуктивністю ми маємо спотворені дані про загальну мутабільності зразка.

Як було показано вище, при лазерному мутагенезі виживання рослин в М [практично не відрізняється від контрольних варіантів. Для усунення зазначеного недоліку при радіаційному мутагенезі деякі автори (Оіз1аГ850п е! А1., 1971; Володін, 1975; Марьюшкін та ін., 1977; Володін, Лісовська, 1979) рекомендували застосовувати низькі дози радіації. Дослідження показа¬лі, що при цьому мутують гени, що визначають розвиток кількісних ознак. Дубінін (1966) вважав, що виникнення малих мутацій, т. Е. Мутацій кількісних ознак, пов'язане з дрібними хромосомними абераціями. Вони не викликають стерильності і впливають на мінливість ознак, що визначають продуктивність рослин. На думку Оіз1а11550п е !: а1. (1966), дрібні хромосомні аберації, що виникають при порівняно невисоких доз опромінення, викликають підвищення врожайності в 15-20 разів частіше, ніж генні мутації. Однак, незважаючи на ці дані, більшість дослідників вважають за краще напівлетальні дози, оскільки при малих дозах частота індукції видимих мутацій дуже низька.

Оскільки радіаційному мутагенезу властиві недоліки, зазначені вище, проблема пошуку тестів ранньої оцінки мутабільності продовжує залишатися актуальною. У цьому зв'язку необхідно коротко зупинитися на досягнутих результатах з тим, щоб на цьому тлі простежити особливості лазерного мутагенезу. Так, наприклад курна, Орлюк (1968) відзначили вплив умов вирощування рослин ячменю в М1 (після гамма-опромінення) на вихід хлорофільних і морфологічних мутацій в М2. При пізньоосінніх терміні сівби М] озимого ячменю Ставропольський 7 спостерігалося підвищення частоти прояву зазначених мутацій в М2. Крім того, ці автори показали значення генотипу в даному явищі. Виявилося, що при пізньому посіві сорту Одеський 17 такої залежності не спостерігається.

У дослідах Батигін і Пітірімова (1973) досліджувався вплив змінених умов вирощування рослин ячменю в М1 на характер прояву в М2 і М3 мутацій, що визначають розвиток таких ознак, як

міцність соломини, опушення насіння, холодостойкость, гіллястість колоса, фертильність та ін. Автори пояснили це явище дією внутрісоматіческого відбору у рослин МЬ Роботи подібного типу, незважаючи на їх суттєву біологічних значимість, ще не давали відповіді про можливості ранньої оцінки мутабільності.

Наступний цикл робіт був присвячений аналізу зв'язку ступеня розвитку рослин в М1 з частотою виявляються мутацій в М2. Однак отримані в цьому плані експериментальні дані дуже суперечливі. І тим не менше більшість дослідників схильні вважати, що пригнічення розвитку рослин в М) супроводжується підвищеною частотою прояву змін деяких ознак.

Так, за даними Пітірімова і Батигін (1971), спостерігається пряма кореляція між частотою стерильних і хлорофільних мутантів в М2 і ступенем пошкодження хромосом ячменю в МЬ Мальченко та ін. (1976) показали пряму кореляцію між ступенем пригнічення в М] таких ознак, як висота соломини, число, вага і крупність зерна пшениці, і частотою морфологічних мутацій в М2.

Філіпек (1976) виявила зворотну кореляцію між виживанням рослин М1 і мутабільності в М2 при посемейственном аналізі двох сортів ячменю, оброблених радіацією і хімічними мутагенами.

Цікаві дані отримані ЕйгепЬе ^ е! а1. (1961). Вони показали, що при зростанні кількості життєздатних мутацій в М2 на 1% в М [повинно відбуватися збільшення стерильності на 7,8% (при використанні рентгенівських променів).

Найбільш близько до вирішення проблеми раннього тестування мутабільності підійшли дослідники, які взяли в якості тесту ряболиста рослин МЬ виникає після обробки насіння мутагенами (Ранчя- лисиць, 1979; Володін, Лісовська, 1979). Ряболиста проявляється на рослинах у вигляді окремих секторів з хлорофільние недостатністю. Такі рослини прийнято називати хлорофільние химерами. Поява таких химер в М1 послужило підставою для використання цієї особливості в якості тесту ранньої діагностики мутабільності. Ніколов та Георгієва (1975) провели подібні дослідження і встановили, що фенотипический спектр плямистості рослин М1 ячменю ідентичний спектру хлорофільних мутантів в М2. При раз¬лічних варіантах модифікації мутагенної ефективності ЕМС спостерігалося збереження виявленої кореляційної зв'язку. Ці дані, на думку авторів, підтверджують причинний зв'язок між секторами з хлорофільние недостатністю і рецесивними хлорофільние мутаціями.

Такі основні досягнення в пошуках тестів ран¬ней оцінки, отримані при використанні радіації і хімічних мутагенів. Як видно, зроблено чимало, однак остаточну відповідь на поставлене питання дати ще неможливо.

Цілком природно, що дана проблема хвилювала нас і при організації робіт по лазерному мутагенезу в сільськогосподарських рослин. Особливо необхідно було цю роботу провести у зв'язку з тим, що лазерний мутагенез істотно відрізняється від радіаційного та хімічного. Як ми вже відзначали вище, при радіаційному мутагенезі, як правило, застосовуються високі дози, що забезпечують 50-відсоткове збереження опромінених рослин і значну втрату генотипів з індукованими мутаціями. Ті, що вижили рослини зазвичай пригнічені і не повною мірою проявляють свій фенотип, а отже, створюються умови для спотворення експресії генів мутантів в наступному поколінні, а також для формування майбутнього потомства опроміненого рослини або облученной популяції.

Проявилися в М2 спадково змінені форми зазвичай мають знижену життєздатність і не можуть використовуватися в якості перспективного мате¬ріала.

І навпаки, у разі лазерного мутагенезу при оптимальних дозах схожість опромінених насіння нормальна, виживають всі рослини МЬ Вони мають досить високу життєздатність. У другому поколінні також не спостерігається депресія росту та розвитку рослин. Індуковані мутанти володіють нормальною життєздатністю, високою плодючістю і по врожайності не поступаються вихідним сортам. Однак при лазерному мутагенезі також доводиться витрачати багато праці для вирощування великої кількості рослин М2. А тому при використанні цього нового мутагена проблема пошуків критеріїв оцінки мутабільності по

М1 стояла теж досить гостро. Цю роботу ми про¬велі на різних різновидах, сортах, гібридах і мутантів ярої пшениці та ячменю і вважаємо, що основною умовою успіху в експериментальному мутагенезі є правильний вибір вихідного матеріалу для досліджень. Енкен (1978) звертав увагу на те, що чутливість до мутагенів, а також мутабільність в значній мірі визначаються генотипом, який часто надає більший вплив на реакцію організму, ніж вид мутагена. Дещо інший под¬ход до даного питання у Дубініна (1971), який вважає, що аналіз великого числа сортів необхідний для того, щоб селекціонер знав, який тип змін він може очікувати при опроміненні певного сорту.

У цьому досвіді був використаний набір різних типів лазерів, що працюють в імпульсному і безперервному режимі випромінювання зі спектральним діапазоном 400-700 нм. Опромінювались повітряно-сухе насіння безпосередньо перед посівом. Методика опромінення полягала в обробці моношару насіння, розташованих на скляних підкладках. Застосовувалося лазерне випромінювання різної щільності потужності: в безперервному режіме- 1 -10 Вт / м2 і в імпульсному-1011-1012 Вт / м2; з дозою опромінення: в безперервному режимі-3-103-104 с і 50-100 спалахів в імпульсному.

Опромінені насіння висівали в полі декілька повторних. Всі рослини М [піддавали примусової ізоляції для запобігання можливості перехресного запилення. В М] аналізували схожість насіння, виживання рослин, наявність домінантних мутацій, а також ступінь розвитку ознак, що характеризують продуктивність рослин. Потомства всіх рослин М! на наступний рік висівали по сім'ям для аналізу другого покоління (М2). В М2 проводили відбір і типізацію спадково змінених форм. Роздільно враховували генотипи зі зміною качест-ських, т. Е. Морфологічних, ознак (остистий, забарвлення і форма колоса, вміст хлорофілу в листках і т. Д.) І генотипи з позитивними змінами господарсько цінних ознак, достовірно перевищують контроль по основних елементах структури врожаю термінах дозрівання, вмістом білка в зерні і т. д. Відібрані в М2 форми пересівали в М3 для вивчення успадкування змінених ознак.

/

10. Зак. 1510 145

При аналізі спадкової мінливості пшениці і ячменю, індукованої лазерним світлом, були виявлені наступні особливості. По-перше, встановлено, що при застосуванні лазерів різних типів в посівах М1 можна спостерігати в одних випадках опромінення пригнічення розвитку рослин, а в інших - стимуляцію. По-друге, незважаючи на це, як при стимуляції, так і при пригніченні в потомстві від таких рослин, т. Е. В М2, по-є з досить високою частотою спадково змінені форми.

По-третє, виявлені істотні відмінності за типами генетичних змін серед рослин, що походять від стимульованих або пригноблених варіантів МЬ Так, наприклад, у варіантах з пригніченням розвитку рослин М] в наступних поколіннях виявляються в основному рослини зі зміною морфологічних ознак, що володіють зниженою продуктивністю. А в тих випадках, де спостерігалася в М] стимуляція розвитку рослин, що визначається за масою насіння з однієї рослини, таких змін з'являлося значно менше.

Однак абсолютно несподівано було виявлено досить багато сімей з успадкованими (в М3 і далі) змінами кількісних ознак, таких, як длі¬на колоса, висота рослини, маса 1000 насіння і т. Д.

Результати досліджень, представлені в табл. 6.1, свідчать про наявність зв'язку між ступенем розвитку рослин в М | і кількістю і якістю проявляються мутацій в М2. Зазначена зв'язок найбільш чітко проглядається при об'єднанні варіантів з різними параметрами опромінення, але забезпечують однотипну реакцію рослин одного сорту на вплив лазерного випромінювання, т. Е. Стимуляцію або пригнічення. Таке об'єднання ми визнали можливим, так як залежність мінливості рослин від параметрів лазерного опромінення показана нами раніше (див. Гл. 4). З табл. 6.1 видно, що при опроміненні лазерним світлом пшениці Тг. рег51сіт, сорти Ленинградка (1-й варіант опромінення), ячменю сорту Надя і низькорослого мутанта ячменю До ™ спостерігалося пригнічення розвитку рослин в М1 у порівнянні з контролем. Депресія торкнулася ряд кількісних ознак і, зокрема, масу зерна з однієї рослини. При аналізі мінливості потомства від таких рослин в М2 було виділено 5-8% мутантів з

зміною морфологічних ознак, які добре успадковувалися в наступних поколіннях. З відносно малою частотою з'являлися форми (0,8-3%) ь характеризуються позитивною зміною господарсько цінних ознак, таких, як висота рослин, розміри колоса, вміст білка та ін. В результаті були відібрані низькорослі, з великим колосом, високобілкові мутанти.

Протилежні результати за частотою виникнення спадково змінених форм рослин отримані в тих варіантах досліду, в яких опромінення лазерним світлом призвело до значної порівняно з контролем стимуляції розвитку основних ознак, що визначають продуктивність рослин. У потомстві рослин таких варіантів було виявлено невелику кількість (0,2-2%) морфологічно змінених сімей. Однак частота сімей із змінами господарсько цінних ознак була досить високою і становила від 7 до 14% залежно від генотипу і параметрів опромінення. Практична цінність цих форм полягає в тому, що багато з них мають комплекс господарсько корисних властивостей і, зокрема, поєднують високу продуктивність з високою якістю зерна або високу продуктивність зі скоростиглістю і т. Д. Дуже важливо, що ступінь успадкування цих ознак була також високою і становила від 30 до 50% залежно від типу виникли змін.

Таким чином, представлені результати досить переконливо свідчать про наявність зв'язку між стимулюючим ефектом лазерного випромінювання в М] і виходом мутантів, що володіють господарсько цінними ознаками і властивостями. Аналогічні результати отримані Корнієнко та ін. (1980). У варіантах обробки гелій-неоновим лазером насіння диплоидной сахар¬ной буряка спостерігалася стимуляція за масою кореня. В М2 цих варіантів виявлені сім'ї з підвищеним на 2,1-2,6% вмістом цукру в порівнянні з контрольними рослинами. У той же час при обробці тетраплоидной буряка при незначному стимуляційному ефекті М [в М2 не виявлено мутантних форм, у тому числі з господарсько цінними ознаками. Такі ж факти про зазначену зв'язку відзначалися при використанні інших мутагенів (Демченко та ін., 1978; Стрельчук, 1978; Шангін-Березовський, 1979).

Виявлена особливість відкриває перспективу для розробки нової, більш ефективної методики мутаційної селекції з використанням лазерного випромінювання. Суть її полягає в тому, що попередній відбір генотипів, що несуть мутації, що визначають розвиток корисних ознак і властивостей, можна проводити вже в М1 в тих випадках опромінення, в яких спостерігається перевищення середньої продуктивності рослин над контролем. В основу розробки такої методики можна покласти виявлений нами ефект посилення біостпмуляціі при комбінованому впливі лазерного світла синьою і червоною областей спектра. Такий спосіб опромінення дозволяє, як показали наші спостереження, отримати стабільно високу стимуляцію розвитку рослин в широкому діапазоні доз опромінення, що видається важливим внаслідок індивідуальної чутливості до світла різних генотипів.

Взагалі метод комбінованої обробки насіння в експериментальному мутагенезі використовується широко. Застосовують роздільно різні види радіації і радіацію спільно з хімічними мутагенами, а також раз¬лічние модифікують речовини і сполуки. Показано, що спільний ефект залежить від дози, концентрації, послідовності обробки та інших умов. Тому вивчення взаємодії різних мутагенних чинників важливо з тієї точки зору, що воно дає додатковий матеріал для розробки системи прийомів, що забезпечують в якійсь мірі спрямовану індукцію спадкових змін.

У наших дослідах з вивчення комбінованої дії лазерного випромінювання були використані певні довжини хвиль у синій (гелій-кадмієвий лазер) і червоною (гелій-неоновий лазер) областях спектра з щільністю потужності 10 Вт / м2 при експозиції 7-103 с.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що комбіноване лазерне опромінення насіння дійсно викликає в М1 виражену стимуляцію у розвитку багатьох кількісних ознак. Так, ¬ приклад, в табл. 6.2 представлені дані, які показують цю особливість на трьох формах ячменю. У сорту Надя по всіх проаналізованими ознаками спостерігалася стимуляція в їх розвитку при комбінованому опроміненні в порівнянні з контролем. У форми Гладкоостий 303 стимуляція відзначена за трьома ознаками, а у

Еректоіда 138, так само як і у сорту Надя, - по всіх вивчених ознаками.

У табл. 6.3 наведені результати аналогічного досвіду, отримані на трьох формах ярої пшениці. Вони свідчать про те, що на пшениці стимулюючий ефект комбінованого лазерного опромінення проявився так само чітко, як на ячмені. Тут у всіх сортів відзначено кращий розвиток трьох вивчених ознак в дослідних варіантах.

Таким чином, ми вправі були очікувати в потомстві цих варіантів появи мутантних форм переважно зі зміною кількісних ознак, що визначають насіннєву продуктивність.

Отримані дані представлені в табл. 6.4. Вони показують високий ступінь відповідності очікуваних результатів фактично отриманим в досвіді. Так, ¬ приклад, у сорту пшениці Лютесценс 62 змінених сімей за кількісними ознаками було на 2,8% більше, ніж сімей з мутірованія якісних ознак. У Радиала і мутанта МЛ-19 ця різниця була ще більш істотна і досягала 2- або 3-кратного значення. На двох генотипах ячменю (Надя і Гладкоостий 303) отримані аналогічні результати. Але тут різниця за частотою мутантів зі змінами кількісних і якісних ознак була більш значною в порівнянні з сортами пшениці.

Як показали спостереження, спектр мінливості так ¬ знаходився в залежності від генотипу рослин. У ячменю сорту Надя зазначалося більше число добре розвинених продуктивних сімей з товстою соломиной. У форми Гладкоостий 303 індукованих значна кількість високорослих рослин. У мутанта Еректоід 138 було виділено багато плотноколосих крупнозерних рослин і значне число хлорофільних мутантів, які з високою частотою виникали також спонтанно.

Цікаві дані були отримані при комбінованому опроміненні пшениці. Лазерне вплив прі¬воділо до вираженої стимуляції В М1 в основному тих ознак, які характеризують продуктивність рослин (див. Табл. 6.3). Іноді одночасно змінювалися кілька таких ознак, особливо продуктивна кущистість, маса зерен і кількість насіння. В М, 2 від цих форм з великою частотою з'являлися сім'ї з високою продуктивною кущистістю, великим, добре озерненность колосом і товстої соломою. Такі форми були в подальшому залучені в різні ланки селекційного процесу.

Таким чином, при належному підборі параметрів лазерного опромінення можна ефективно змінювати спадковість пшениці і ячменю в бік підвищення частоти індукції господарсько цінних форм.

Отже, результати проведених досліджень дії комбінованого опромінення показали, по-перше, можливість значного посилення стимулюючого ефекту шляхом поєднання синьою і червоною областей спектра і, по-друге, перспективи застосування послідовного впливу низькоінтенсивних випромінюванням зазначених довжин хвиль для переважної індукції мутацій генів, що визначають розвиток кількісних ознак, відповідальних за насіннєву продуктивність пшениці та ячменю.