Пероксид водорода

Образование пероксида водорода Н₂О₂ происходит при последующем получении еще одного (т.е. второго) электрона кислородом, а также в результате взаимодействия (дисмутации) двух молекул О₂^- :

2 О₂^- + 2Н⁺  Н₂О₂ + О₂

Пероксид водорода способен легко проникать через мембраны клеток. Н₂О₂ обнаруживается при фагоцитозе, его образование также сопряжено с работой митохондрий и микросом. Максимальная скорость образования Н₂О₂ в митохондриях, составляющая в присутствии НАД-зависимых субстратов 0,3-0,6 нмоль Н₂О₂/ мин мг белка, в норме наблюдается в метаболическом состоянии 4. Считается, что за прямое образование Н₂О₂ ответственен убихинол (QH₂), большая часть Н₂О₂ митохондрий вырабатывается при дисмутации О₂^-, образованных в ходе аутоокисления семиубихирона (QH^) и цитохрома b₅₆₆. 80% Н₂О₂, образующейся вблизи функционирования белков ЭТЦ, диффундирует через внутреннюю мембрану в михондриальный матрикс, а 20% - в цитозоль. Часть Н₂О₂ может генерироваться в цитозоле при функционировании ксантиноксидазы и альдегидоксидазы. Под действием ксантиноксидазы О₂ превращается в О₂^- и Н₂О₂. Определенное количество Н₂О₂ образуется также в процессе окислительного дезаминирования норадреналина, адреналина и серотонина, катализируемого моноаминооксидазой, локализованной на наружной митохондриальной мембране.

Пероксид водорода может генерировать гидроксил-радикал в присутствии двухвалентного железа. Рекомбинация Н₂О₂ и Fe²⁺, описываемая реакцией Фентона, служит основным механизмом образования ОН^-радикала:

Fe²⁺ + Н₂О₂  Fe³⁺ + ОН^ + ОН^-

Образование ОН^ может также осуществляться в реакции Хабера-Вайса, в которой также участвует Н₂О_2, а также ионы металлов переменной валентности Меⁿ⁺, например, железо(III), медь(II), которые восстанавливаются в ходе этого процесса:

Н₂О₂ + О₂^-  ОН^- + ОН^+ О₂

Измерение Н₂О₂ в биосубстратах проводят обычно методом титрования перманганатом калия, реакцией с молибдатом аммония или с помощью спектрофотометрического метода при длине волны 240нм. Используют также пероксидазную реакцию, в ходе которой изменяется окраска индикатора, например, индигокармина. Применяют также флуориметрические методы.

Гидроксильный радикал

К образованию гидроксильных радикалов, обладающих высокой реакционной способностью, приводит одноэлектронное восстановление Н₂О₂. Однако разложение Н₂О₂ в присутствии ионов металлов переменной валентности служит основным путем образования ОН^. Образование ОН^ - радикалов в присутствии ионов переходных металлов описывается реакциями Фентона и Хабера-Вайса, представленных выше. Вследствие высокой химической активности время жизни ОН^ -радикалов в клетке составляет около 100 мкс, а расстояние которое они успевают пройти от места их образования, не превышает 100нм. Таким образом, эффективность повреждающего действия ОН^ - радикалов будет зависеть от места их образования. Например, образование ОН^ -радикалов вблизи молекулы ДНК приводит к модификации основания или разрыву одной или обеих цепей ДНК. Взаимодействие ОН^ с биомолекулами обычно приводит к образованию другого менее реакционноспособного радикала, который способен к диффузии и к продолжению цепной реакции за счет взаимодействия с новыми молекулами. Примером такого цепного процесса может быть пероксидное окисление ненасыщенных липидов, индуцируемое гидроксильными радикалами (Осипов А.И., Азизова О.А., Владимиров Ю.А., 1990).

Для ОН^ - радикалов характерны три основных типа реакций:

1. Отрыв атома водорода от органической молекулы.

ОН^ + СН₃ОН  Н₂О + ^СН₂ОН

2. Присоединение к молекуле по двойной связи.

ОН^ + С₆Н₆  ^С₆Н₆ОН

3. Перенос электрона

ОН^ + Сl^-  ^Cl + ОН^-

Так, взаимодействие ОН^ с лецитином, основным компонентом биологических мембран относится к первому типу реакций и является основной реакцией при инициировании ПОЛ в мембранах. Сюда же относится и реакция ОН^ с сахарами, например, дезоксирибозой, входящей в состав оснований ДНК. Продукты этого взаимодействия обладают мутагенными свойствами. Ко второму типу реакций относятся реакции взаимодействия ОН^ -радикалов с пуриновыми и пиримидиновыми основаниями ДНК и РНК. Так, взаимодействие ОН^ с тимином приводит к образованию ряда вторичных радикалов, которые могут повреждать другие основания и сахара, а также вызывать разрывы цепей нуклеиновых кислот. Такое повреждение может привести к мутации и гибели клетки.

Среди методов обнаружения ОН^ - радикалов следует отметить три основные группы: 1) метод ЭПР; 2) хроматографические методы, позволяющие обнаружить продукты гидроксилирования органических соединений, образующихся с участием ОН^ - радикалов; химические методы, основанные, например, на определении этилена, образующегося из метионалия в присутствии ОН^ -радикалов.

Метод ЭПР позволяет непосредственно обнаруживать свободные радикалы, если их концентрация поддерживается на уровне 10^-6 – 10^-7М во время измерения. Поскольку обычно радикалы нестабильны, их регистрация возможна только с помощью специальных методик. Одно из решений – использование струевых методов, в которых постоянная и притом высокая концентрация радикалов поддерживается в результате непрерывного смешивания реагентов. Другой подход – метод быстрого замораживания и тем самым стабилизации радикалов, образовавшихся в результате быстрого смешивания реагирующих веществ. Однако струевые методы требуют больших объемов при высоких концентрациях реагентов и практически непригодны, когда речь идет об изучении биологических объектов. Кроме того, струевые методы не позволяют изучать короткоживущие радикалы с временем полупревращения менее 1мс, которое соответствует мертвому времени лучших устройств для быстрого смешивания. В связи с этим, большее распровтранение получил метод спиновых ловушек. Применение этого метода для изучения О₂^- радикалов рассмотрено выше.

Достаточно удобным методом обнаружения ОН^ - радикалов в различных биологических системах является анализ продуктов гидроксилирования производных ароматических соединений, например, с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ). Анализ продуктов гидроксилирования с помощью ГЖХ, цветных реакций или флуорометрический анализ позволяют количественно измерить выход ОН^ - радикалов в изучаемой системе и влияние различных соединений (акцепторов ОН^ -радикалов) на их концентрацию в системе.

Третьей часто используемой группой методов обнаружения ОН^ - радикалов является определение количества этилена в реакции ОН^ - радикалов с метионалем или 4-метилтио-2-оксимасляной кислотой. Образование этилена из метионаля протекает согласно суммарной реакции:

СН₃-S-(СH₂)₂-CНО + ОН^  СН₂=СН₂ + НСООН + СН₃-S-S-CH₃

Однако эта реакция может протекать не только в присутствии ОН^ - радикалов, но и других сильных окислителей, таких, как алкоксильные и перекисные радикалы. В этом случае может помочь применение перехватчиков радикалов, к числу которых относятся и многоатомные спирты, маннит и некоторые другие соединения. Перехватчики снижают скорость реакций с участие гидроксильных радикалов, причем степень снижения пропорциональна константе скорости взаимодействия перехватчика со свободжным радикалом.

Говоря о методах определения АФК, нельзя обойти молчанием метод хемилюминесценции. Все системы, в которых образуются АФК – ксантин-ксантиноксидаза, активированные фагоциты, реактив Фентона и другие, обладают хемилюминесценцией. Низкая интенсивность этого свечения и сильная зависимость от случайных примесей заставляет использовать в биологических системах активаторы хемилюминесценции, из которых наиболее известен 3-аминофталовый гидразид – люминол. Люминол вступает в прямое химическое взаимодействие с радикалами ОН^ и О₂^-. В присутствии ОН^ образуется радикал люминола, который вступает в реакцию с О₂^-, образуя перекисный радикал. В результате ряда внутримолекулярных перестроек образуется 3-аминофталат в возбужденном электронном состоянии, переход которого в основное состояние сопровождается испусканием кванта света.

В гнанулоцитах крови содержится фермент миелопероксидаза, катализирующая реакцию образования гипохлорита (СlO^-) из Н₂О₂ и анионов хлора. Образующийся СlO^- является сильным окислителем и также может окислять люминол. Таким образом, свечение гранулоцитов связано не только с образованием ими ОН^ и О₂^- - радикалов, но и с образованием гипохлорита. Вероятно, в гранулоцитах реакция окисления люминола протекает по механизму с участием гипохлорита или оксигенированной формы миелопероксидазы.

Другим активатором хемилюминесценции является 10, 10^’- диметилбиакридиний – люцегинин. Химические превращения люцегинина при его взаимодействии с радикалами, как и в случае с люминолом, протекают в две стадии. На первой стадии, которая может катализироваться флавинами и ионами металлов, образуется катион-радикал люцегенина. На второй стадии процесса происходит оксигенирование продукта одноэлектронного восстановления люцегинина в реакции с супероксидным радикалом. Оксигенированный продукт имеет диоксиэтановую природу и может распадаться с образованием возбужденных N-метилакридоновых фрагментов – эмиттеров хемилюминесценции.

Люминол и люцегинин различным образом активируют хемилюминесценцию, возникающую при активации полиморфноядерных лейкоцитов различными по природе стимулами. Так, активация клеток частицами зимозана стимулирует преимущественно реакции в фаголизосомах, и хемилюминесценция активируется сильнее люминолом, который может связываьбся с белковыми и липидными компонентами частиц. Активация клеток форболмиристат-ацетатом вызывает выброс супероксидных радикалов во внеклеточную среду. В этом случае хемилюминесцентные реакции сильнее активируются люцигенином.

Следует еще раз подчеркнуть, что как гидроксил-радикал, так и гипохлорит-анион, являются сильными окислителями. Они способны модифицировать белки, нуклеиновые кислоты, индуцировать ПОЛ (от которого наиболее сильно «страдают» полиненасыщенные мембранные липиды) и в результате цепных реакций приводить к множественным нарушениям мембран и к гибели клеток. Важным дополнением этих реакций является способность NO-радикала при взаимодействии с супероксид-анионом образовывать пероксинитрит, который может индуцировать апоптоз (запрограммированная гибель клеток), а в ходе своего спонтанного распада превращаться в гидроксил-радикал. Последний может образовываться также из гипохлорит-аниона в присутствии ионов железа.

Синглетный кислород

Образование ¹О₂ играет важную роль в реакциях фотоокисления биологических субстратов в присутствии окрашенных соединений -–фотосенсибилизаторов. Схема таких реакций может быть представлена в виде

¹А + h  ¹А^  ³А

³А + ³О₂  ¹А + ¹О₂ ,

где ¹А и ³А - молекулы фотосенсибилизатора соответственно в синглетном и триплетном состоянии; ¹А^ - синглетное возбужденное состояние. Таким образом, при взаимодействии молекулы О₂, находящейся в основном триплетном состоянии, с молекулой фотосенсибилизатора, находящейся в триплетном возбужденном состоянии, образуется “синглетный кислород”, который в дальнейшем может вступать в реакции, и впервую очередь – с двойной связью. Весьма эффективными сенсибилизаторами являются многие пигменты и красители: гематопорфирин, флавины, хлорофиллы, эозин, метиленовый синий, бенгальский розовый. Образование ¹О₂ возможно и при нефотохимических реакциях в результате дисмутации супероксидных радикалов, а также при взаимодействии некоторых сильных окислителей, например гипохлорита, с Н₂О₂:

О₂^- + О₂^-  ¹О₂ + Н₂О₂

В отличие от молекулы О₂ в основном состоянии ¹О₂ обладает высокой химической активностью. Типичными для ¹О₂ являются реакции взаимодействия с двойной связью, протекающие с образованием диокиэтанов, которые в дальнейшем могут переходить в гидроперекиси.

О - О О - ОН

  

О=О + R₁- СН=СН- R₂  R₁- СН - СН- R₂  R₁- СН – СН₂ - R₂

Синглетный Диоксиэтан Гидроперекись

кислород

Это свойство ¹О₂ особенно важно для инициирования пероксидного окисления ненасыщенных жирных липидов в биологических мембранах. Д.И. Рощупкин и соавт. (Roshchupkin D.I. et al., 1975), что при УФ-облучении полиненасыщенных жирных кислот в присутствии сенсибилизаторов и О₂ происходит образование гидроперекисей липидов, что в последующем приводит к развитию реакций цепного окисления в результате образования радикалов при разложении этих гидроперекисей либо фотохимическим путем, либо в присутствии металлов переменной валентности. Альтернативой химическим реакциям с участием ¹О₂ является его «тушение», т.е. переход в основное, триплетное состояние. Тушение осуществляется в результате переноса энергии возбуждения от ¹О₂ к молекуле тушителя. Одним из самых эффективных тушителей в клетке является - каротин, одна молекула которого способна потушить около 1000 молекул ¹О₂ до того, как - каротин подвергнется деградации в результате химических реакций окисления. Но основным тушителем ¹О₂ в клетке является вода. В отсутствие процессов тушения самопроизвольный переход ¹О₂ в основное состояние все равно происходит, но сопровождается люминесценцией.

Энергичное образование ¹О₂ в клетке может приводить к ее повреждению или гибели. Так, врожденное нарушение метаболизма порфиринов, сопровождающееся их накоплением в коже, приводит обычно к порфириям, сопровождающимся воспалением кожных покровов, их утолщением и повышенным шелушением эпителия.

Специально добавляемые к растворам тушители могут использоваться для доказательства участия ¹О₂ в тех или иных процессах: в присутствии тушителей скорость изучаемой реакции снижается. Впрочем, этот способ не очень специфичен, поскольку использованные соединения могут оказывать влияние на изучаемую систему, вступая и в другие реакции. Чаще других в качестве тушителя ¹О₂ используется 1,4 – диазабициклооктан, являющийся относительно неактивным (его обычная рабочая концентрация – до 50мМ). Ион азида (-N₃^-) также используется для тушения ¹О₂ . Азид более эффективен, 1,4- диазабициклооктан, однако ингибирует многие гемовые ферменты и легко реагирует с ^ОН-радикалами.