§ 4. Количественное определение

Методика количественного определения аскорбиновой кислоты в плодах шиповника (Fructus Rosae) (по ГФ X, ст. 293). Метод коли­чественного определения аскорбиновой кислоты основан на способ­ности восстанавливать 2,6-дихлорфенолиндофенол:

НО ОН Н I

Аскорбиновая 2, 6-дихлорфенолиндофенол кислота

О О С1

J HI 1 Г _

,он

< VO+HO-«Q>-NH-<^>-OH

tin

дегидроаскорбиновая 2, 6-дихлорфенолиндофенол кислота (вовстан. форма)

2,6-дихлорфенолиндофенол в щелочной среде имеет синюю ок­раску, в кислой — красную, а при восстановлении обесцвечивается:

С1

ONa;

синий красный

а

I

но—^I/^1-ш~°^н

бесцветный

20 г целых или 10 г очищенных плодов шиповника в ступке растирают со стеклянным порошком (около 5 г) при постепенном добавлении 300 мл дистиллированной воды. Настаивают 10 мин, затем размешивают, центрифугируют или фильтруют. В кониче­скую колбу вместимостью 50—100 мл вносят 1 мл 2%-ного раствора НС1, затем 1 мл полученного извлечения и 13 мл воды и титруют из микробюретки 0,001 н. раствором 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 1/2—1 мин. Титрование должно проводиться не более 2 мин. В слу­чае интенсивной окраски центрифугата или фильтрата или высо­кого содержания аскорбиновой кислоты (расход раствора 2,6-ди-

хлорфенолиндофенолята натрия более 2 мл), обнаруженного проб­ным титрованием, их разводят перед титрованием водой в два раза или более.

1 мл 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия соответствует 0,000088 г аскорбиновой кислоты.

Процентное содержание аскорбиновой кислоты (я) в пересчета на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле

_ 1^0,000088^100 • 100 mVV(100—w)

где V — объем 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия, пошедшего на титрование, мл; F — поправка на титр 0,001 н. раствора 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия; V₁ — объем извлечения, соответствующий всей навеске, мл; т — масса навески сырья, г; V₂ — объем извлечения, взятого для титрования, мл; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.

Приготовление 0,001 н. раствора 2,6-д ихлорфенолин- дофенолята. 0,22 г 2,6-дихлорфенолиндофенола растворяют в 500 мл свеже- прокипяченной и охлажденной воды при энергичном взбалтывании (для растворе­ния навеску оставляют на ночь). Раствор фильтруют в мерную колбу и доводят объем раствора водой до 1 л. Срок годности раствора не более 7 сут при усло­вии хранения в холодном, темном месте.

Установка титра. Несколько кристаллов (3—5) аскорбиновой кислоты растворяют в 50 мл 2% -ного раствора H₂S0₄. Полученный раствор в ко­личестве 5 мл титруют из микробюретки рабочим раствором 2,6-дихлорфенолин­дофенола до появления розового окрашивания, исчезающего в течение 1—2 мин. Другие 5 мл этого же раствора аскорбиновой кислоты титруют точно 0,001 н. раствором иодата калия в присутствии нескольких кристаллов (около 2 мг) иодида калия и 2—3 капель раствора крахмала до появления голубого окрашивания.

Поправочный коэффициент К вычисляют по формуле К — У!Уъ где V — объем точно 0,001 н. раствора иодата калия, пошедшего на титрование, мл; Vj — объем раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола, пошедшего на титрование, мл.

Содержание аскорбиновой кислоты должно быть для цельного сырья не менее 1 % (ГФ X).

Реактивы и оборудование: вода дистиллированная; аскорбино­вая кислота; натрий 2,6-дихлорфенолиндофенолят; НСГ2%-ная; H₂S0₄ 2%-ная; калий иодид; калий иодат; крахмал (р-р).

Бумага фильтровальная; вата гигроскопическая; стеклянный порошок; весы ручные; ступка фарфоровая с пестиком; колбы конические вместимостью 50, 100, 500 мл; цилиндры мерные на 15, 50, 100 мл; колбы мерные вместимостью 1 л; стаканы химические вместимостью 300 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5—10 см; бюретки вместимостью 25 мл; пипетки измерительные вме­стимостью 25 мл.

Методика количественного определения каротина в плодах ря­бины обыкновенной (Fructus Sorbi). Метод основан на экстракции каротина органическими растворителями (ацетон, бензин), очистки от сопутствующих'веществ методом хроматографической адсорб­ции. Количество каротина в очищенном растворе определяют коло­риметрически по интенсивности желтой окраски раствора срав­нением его с раствором азобензола или раствором дихромата ка­лия, который стандартизован по чистому каротину.

5—20 г измельченного сырья тщательно растирают в ступке с кварцевым песком или стеклянным порошком. Так как каротин

ю - в кислой среде неустойчив, то для нейтрализации кислот при расти­рании добавляют немного карбоната натрия. После растирания в ступку постепенно прибавляют 10 мл ацетона и снова растирают материал. Затем содержимое ступки фильтруют под вакуумом, смывают ступку ацетоном и промывают материал на фильтре не­большими порциями ацетона до исчезновения окраски стекающего фильтрата. Ацетоновый экстракт переносят в делительную воронку. Чтобы перевести пигмент в бензин, к экстракту в делительной во­ронке добавляют 10—20 мл бензина и смесь тщательно перемеши­вают. Ацетон из смеси удаляют промыванием водой, добавляя ее в делительную воронку небольшими порциями и слегка встряхивая смесь. Промывные воды сливают, они не должны содержать раство­римых в бензине пигментов.

Полностью освобожденный от ацетона бензиновый раствор су­шат фильтрованием через безводный сульфат натрия. После этого хроматографической адсорбцией в бензиновом растворе отделяют каротин от хлорофилла, ксантофилла, ликопина и других пиг­ментов.

На дно хроматографической колонки (диаметр 1—1,5 см, длина 15—20 см) плотно вставляют ватный тампон толщиной 1 см, который препятствует прохождению адсорбентов в приемник. Затем в ко­лонку вносят небольшими порциями оксид алюминия, слегка уплот­няя каждую порцию стеклянной палочкой. Длина столбика адсор­бента в колонке должна составлять 5—7 см. Бензиновый раствор пигментов при слабом отсасывании пропускают через хроматогра- фическую колонку (необходимо следить, чтобы на поверхности ад­сорбента постоянно был слой бензина, так как каротин окисляется под действием воздуха). Затем через колонку пропускают чистый бензин, пока весь каротин, отделяясь от других пигментов в виде желтой Полоски, не пройдет в приемник. Каротин адсорбируется оксидом алюминия слабее других пигментов. Конец хроматографи- рования определяют по исчезновению желтой окраски вытекающего из колонки элюата. Бензиновый раствор каротина переносят в мер­ную колбу вместимостью 100 мл и доводят бензином до метки. Так как химически чистый каротин нестойкое вещество, то при колори- метрировании в качестве стандартного раствора используют раствор азобензола или раствор дихромата калия. "

При колориметрировании в одну кювету наливают стандартный раствор, а в другую раствор каротина. Если раствор каротина получается слишком концентрированным, то рекомендуется перед колориметрированием разбавить его бензином.

Процентное содержание суммы каротиноидов вычисляют по формуле

/flOOWtxlOO *⁼/ЯЛ₂(100-ву) '

где К — количество каротина в 1 мл стандартного раствора равно 0,00208 мг, если стандартный раствор—дихромат калия, и 0,00235 мг, если стандартный раствор—азобензол; V — объем бензинового раст­вора каротина, мл; — оптическая" плотность стандартного раст­вора; h₂ — оптическая плотность исследуемого раствора каротина; т — масса навески абсолютно сухого сырья, г; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.

П р и г о т о вл ение стандартных растворов. Приготовле­ние стандартного раствора азобензола: 0,145 г предварительно перекристаллизо­ванного из этилового спирта и высушенного азобензола растворяют в 100 мл. 95%-иого этилового спирта. Для работы основной раствор азобензола разбавляют в 10 раз: берут 10 мл основного раствора и доводят до метки 95%-ным этило­вым спиртом в мерной колбе вместимостью 100 мл. Хранят раствор в темном месте.

Приготовление стандартного раствора дихромата калия: 0,360 г перекри­сталлизованного дихромата калия растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Реактивы и оборудование: азобензол; калия дихромат; ацетон; бензин; алюминия оксид (просеянный через сито с размером отверстий 0,25 мм); Na$C0₃; NajS0₄ (безвод.).

Вата гигроскопическая; кварцевый песок или стеклянный порошок; ступка фарфоровая с пестиком'; колба вместимостью 25 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 3—5 см; колонка хроматографическая; ворднки дели­тельные вместимостью 200 мл; колбы Бунзена; колбы мерные вместимостью 50, 100 и 1000 мл; цилиндры мерные на 50 мл; фото электроколориметр <Й?К-М.

Вопросы ДЛЯ ПОДГОТОВКИ

1. Определение витаминов.

2. Классификация витаминов.

3. Физико-химические свойства витамина С- и каротиноидов.

4. Растения, богатые витамином С и каротиноидами,

5. Методы обнаружения витамина С и каротиноидов в растительном сырье.

6. Количественное определение витамина С и каротиноидов.

Литература

Гаммерман А. Ф. Курс фармакогнозии. — Л.: Медицина, 1967.

Кушманова О. Д., Ивченко Г. М. Руководство к практическим занятиям по биологической химии. — М-: Медицина, 1974.

Машковский М. Д. Лекарственные средства. — М.: Медицина, 1977.

Плешков Б. П. Практикум по биохимии растений. — М.: Колос, 1968.

Березовская Н. Н. О витаминах. — М.: Медицина, 1975.

ГЛА.ВА 2. ЭФИРНЫЕ МАСЛА

Эфирные масла (Olea aetherea) —смесь душистых летучих ве­ществ, образующихся в растениях и относящихся к различным классам органических соединений, преимущественно терпеноидам (кислрродные соединения терпенов), реже к ароматическим и али­фатическим соединениям. Среди них встречаются углеводороды, спирты, кетоны, альдегиды, фенолы, лактоны, кислоты, простые и сложные эфиры и др.

Свое название эфирные масла получили благодаря наличию характерного ароматного запаха и маслообразной консистенции. В отличие от жирных масел они испаряются, не оставляя жирного пятна. Эфирные -масла широко распространены в растительном мире. В настоящее время известно до 2500 эфирномасличных расте­

ний, относящихся к различным классам — от низших до покрыто­семянных. При этом ряд семейств выделяется особенно большим числом эфирнбмасличных растений; это астровые (сложноцветные), яснотковые (губоцветные), сельдерейные (зонтичные), миртовые, лавровые, розоцветные и др.

Эфирные масла могут накапливаться в любых органах растений: цветках розы и лаванды, плодах сельдерейных и цитрусовых, листьях яснотковых, в подземных органах аира, ириса, девясила. Их содержание для различных растений составляет от тысячных долей процента до 5 %, а для некоторых видов, например бутонов гвоздичного дерева, — 20 %.

В растениях эфирное масло локализуется, как правило, в спе­циальных образованиях. Различают экзогенные и эндогенные обра­зования.

Экзогенные: а) эфирномасличные железки, которые имеют раз­личное строение; б) железистые волоски; в) железистые пятна.

Эндогенные: а) эфирномасличные вместилища; б) эфирномаслич­ные канальцы; в) секреторные ходы; г) специализированные парен- химные клетки.